방법 논문

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

DOI:

10.3791/61657

⸱

2020년 9월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

이 논문에서

요약

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초고속 서양 블로팅 기술은 면역 반응 강화 제와 함께 순환 배수 및 보충 (CDR) 기술을 통해 결합하는 항원 항체의 운동성을 개선하여 개발됩니다.

초록

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서양 블롯 (또한 면역 blot로 알려진) 생물 의학 연구를 위한 정식 방법. 그것은 일반적으로 특정 단백질의 상대적인 크기와 풍부 뿐만 아니라 번역 후 단백질 수정을 결정 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 풍부한 역사를 가지고 있으며 단순성으로 인해 널리 사용됩니다. 그러나, 서쪽 블로팅 절차는 유명한 처리량을 제한하는 긴 잠복기인 중요한 병목 현상으로 완료하는 데 몇 시간, 심지어 며칠이 걸립니다. 이러한 배양 단계는 막에 고정된 항원에 대한 벌크 용액에서 항체의 느린 확산으로 인해 요구된다: 막 근처의 항체 농도는 벌크 농도보다 훨씬 낮다. 여기서, 우리는 항체 용액의 순환 배수 및 보충 (CDR)을 통해 항원 결합을 개선하여 이러한 배양 간격을 극적으로 감소시키는 혁신을 제시한다. 우리는 또한 분석의 감도를 보존하기 위해 면역 반응 향상 기술을 활용했습니다. CDR 방법과 상용 면역반응 강화제의 조합은 출력 신호를 증폭시키고 항체 인큐베이션 시간을 실질적으로 감소시켰다. 그 결과 초고속 서부 얼룩은 감도 손실 없이 20분 만에 달성할 수 있습니다. 이 방법은 화학 발광 및 형광 검출을 모두 사용하여 서부 얼룩에 적용 될 수있다. 이 간단한 프로토콜은 연구원이 많은 견본에서 단백질 발현의 분석을 더 잘 탐구하는 것을 허용합니다.

서론

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서양 얼룩 (또한 면역 blot로 알려진) 과학 및 임상 분야의 광범위 에 걸쳐 강력하고 기본적인 기술이다. 이 기술은 단백질1의존재, 상대적 풍부, 상대 분자 질량 및 번역 후 수정을 검사하는 데 사용됩니다. 디지털 이미지 분석과 결합하여, 이 방법은 단백질과 단백질 변형의 풍요로움을 안정적으로 분석할 수있다 2. 서양 얼룩은 일상적으로 수행되지만 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 방법입니다. 막이 있는 항체의 긴 배큐어가 필요합니다. 여기서는 민감도를 희생하지 않고 이러한 제한을 극복하는 인큐베이션 방법의 수정을 설명합니다.

막의 인큐베이션 도중, 항원은 막에 고정되는 동안 항체는 용액에 떠 있습니다. 그들의 높은 친화성 때문에, 항원에 결합하는 항체의 비율은 막에 벌크 용액에서 항체의 확산 보다는 빠릅니다. 이렇게 하면 농도가 낮은 "고갈 층"(그림1)이생성됩니다. 이 기술의 긴 잠복 시간을 담당하는 주요 인자인 수동 확산을 통해 더 먼 항체가 막에 도달하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 효과를 MTL(대량 전송 제한)3이라고합니다. 항체 함유 용액을 반복적으로 배수하고 보충하면 고갈층을 방해하고 MTL4를극복할 수 있다는 것이 제안되었다. 여기서, 우리는 전통적인 서쪽 blotting 프로토콜에서 MTL의 효과를 감소시키고 현저하게 필요한 잠복기를 단축하기 위해이 순환 배수 및 보충 (CDR) 개념을 구현하는 독특한 기술을 고안했다.

짧은 배양 시간으로 검출 감도를 유지하기 위해 항원-항체 반응을 가속화하는 면역 반응 강화 기술을 사용하여 신호 대 잡음 비5를개선하였다. 많은 시판 가능한 면역 반응 향상 제 (IRE)는 2 개의 구성 요소 (솔루션 1 및 2, 재료 표참조)로 구성됩니다. IRE의 독점적 조성 또는 작용 메커니즘은 공개되지 않았지만, 우리는 이전에 IRE가 고체 상 결합 작용에서 항원과 항체 사이의 해리상수를 감소시켰으며, 증가친화도를 나타내는 것은 적어도 부분적으로 IRE6의강화 효과에 책임이 있음을 발견하였다. CDR과 IRE의 조합은 감도를 희생하지 않고 전체 프로시저 시간을 줄이는 초고속 서부 블로팅 프로토콜을 생성합니다.

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프로토콜

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1. SDS 페이지 및 PVDF 멤브레인으로 전송

  1. SDS-PAGE를 수행하여 상대적인 크기에 따라 단백질을 분리합니다.
    참고: 상업용 또는 수제 젤 시스템은 괜찮습니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
  2. 분리된 단백질을 젤에서 PVDF 멤브레인으로 전달합니다.
    참고: 일반적인 전송 방법(반건조 또는 습식 전송)이 적합합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.

2. PVDF 멤브레인 차단

  1. 실온에서 교반하여 1h에 적합한 차단 버퍼로 멤브레인을 배양합니다.
    참고: 1차 항체 및 검출 시스템에 따라 적절한 차단 버퍼를 선택해야 합니다. 예를 들어, 가장 일반적인 차단제는 BSA, 무지방 건조 우유, 카제인 및 상업용 합성 폴리머입니다. PBS 및/또는 0.1% Tween20을 사용하는 TBS는 가장 일반적으로 사용되는 버퍼입니다. 이러한 차단 단계는 4°C에서 하룻밤 사이에 수행될 수 있다.

3. 1 차 항체와 인큐베이션

  1. 증류수로 10% 면역반응 강화 제-1 용액(IRE-1)을 준비한다. 소용돌이 잘.
  2. 희석된 1차 항체를 10% IRE-1로 준비한다. 부드럽게 충분히 섞으세요.
  3. 더 큰 멤브레인(4cm x 8cm - 8cm x 8cm)을 사용하는 경우, 항체 용액8mL을 50mL 원심분리관에 넣습니다. 더 작은 멤브레인(2cm x 8cm - 4cm x 8cm)을 사용하는 경우, 항체 용액3mL을 14mL 원형 바닥 폴리프로필렌튜브(재료 표)에넣습니다.
  4. 핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 블로킹 용액을 간단히 배출하십시오. 장갑을 낀 손가락으로 PVDF 멤브레인을 이 튜브에 삽입하고 전체 멤브레인이 튜브 벽에 부착되도록 합니다. PVDF 멤브레인이 튜브에 삽입되면 원래 안쪽에 겔과 접촉했던 멤브레인의 "단백질 측면"에 직면하십시오. 캡을 단단히 닫습니다.
  5. 50mL 튜브를 유리 병에 삽입하여 혼성화 오븐에 넣습니다.
    참고: 이 배양에 14mL 튜브를 사용하면 플라스틱 링 홀더 쌍을 사용하여 50mL 튜브의 중앙에 내부 튜브를 유지하여 50mL 튜브에 14mL 튜브를 삽입하십시오.
  6. 혼성화 오븐을 켭니다.
  7. 6rpm 회전으로 멤브레인을 5분 이상 배양합니다.
    참고: 멤브레인이 항상 벽에 부착되어 있고 (내부) 튜브가 수평으로 수평되어 항체 용액으로 멤브레인을 균일하게 덮는지 확인하십시오. 실제 실험 전에 항체 및 배양 시간의 희석을 교정한다.

4. 멤브레인 워시

  1. 회전을 중지합니다.
  2. 핀셋으로 튜브에서 PVDF 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 멤브레인을 PBS-T50mL의 용기에 넣습니다.
  3. PBS-T로 멤브레인을 간단히 헹구는 다.
  4. 거품이 나타나지 때까지 증류수로 용기에 멤브레인을 헹구는 다. 이것은 항체의 대부분을 제거하는 것입니다.
  5. PVDF 멤브레인을 용기에서 PBS-T 250mL가 들어 있는 샐러드 스피너로 옮기습니다.
  6. 스피너에 스트레이너 바구니를 놓습니다. 뚜껑을 단단히 고정했는지 확인합니다.
  7. 스피너를 활성화하고 약 20-30 s로 실행합니다.
  8. 용액을 버리고 스피너 내부를 증류수로 간략하게 헹구십시오.
  9. 다시 스피너에 PBS-T의 250 mL을 추가합니다.
  10. 4.6 및 4.7 단계를 반복합니다.

5. 이차 항체를 가진 배양

  1. 증류수로 10% 면역반응 강화 제2용액(IRE-2)을 준비한다. 소용돌이 잘.
  2. 희석된 이차 항체를 10% IRE-2로 준비한다. 부드럽게 충분히 섞으세요.
  3. 3.3 단계에서 명시된 바와 같이 항체 용액 및 튜브의 부피를 선택한다.
  4. 핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 용액을 간단히 배출하십시오. 3.4 단계에서 명시된 대로 PVDF 멤브레인을 튜브에 삽입합니다.
  5. 50mL 튜브를 유리 병에 삽입하여 혼성화 오븐에 넣습니다.
  6. 혼성화 오븐을 켭니다.
  7. 6rpm 회전으로 멤브레인을 5분 이상 배양합니다. 멤브레인이 항상 벽에 부착되어 있는지 확인하고 (내부) 튜브가 항체 용액으로 멤브레인을 균일하게 덮기 위해 수평인지 확인하십시오.
    참고: 실제 실험 전에 인큐베이션 시간을 보정합니다. 이차 항체가 형광으로 수렴되면 어둠 속에서 배양을 수행합니다.

6. 멤브레인 워시

  1. 4.1~ 4.10단계를 따르십시오.

7. 이미지 수집

  1. 화학 발광 검출
    1. 평평한 표면에 반 이식 플렉시블 필름(10cm x 15cm)을 놓습니다.
    2. 5mL 튜브에 화학 발광 기판의 2 성분을 혼합합니다.
    3. 혼합 기판의 1.5mL를 반이식 플렉시블 필름으로 즉시 이송하고 PVDF 멤브레인을 배치한다. 그런 다음 기판 용액의 나머지 부분을 멤브레인으로 이송합니다.
    4. PVDF 멤브레인을 반투명 플렉시블 필름에 혼합 기판으로 1분 동안 배양합니다.
    5. 핀셋으로 PVDF 멤브레인을 선택하고 기판 용액을 간단히 배출하십시오.
    6. 투명 필름 한 쌍 사이에 멤브레인을 샌드위치.
    7. 화학 발광 모드에서 이미지를 획득합니다.
  2. 형광 검출
    1. 핀셋으로 PVDF 멤브레인을 집어 들고 용액을 간단히 배출하십시오.
    2. 투명 필름 한 쌍 사이에 멤브레인을 샌드위치.
    3. 형광 모드에서 이미지를 획득합니다.
      참고: 7.1 단계와 7.2 단계는 최대 감도를 보장하기 위해 이미징 기계와 가까운 곳에서 수행해야합니다.
    4. 배경 신호가 높을 때, PBS-T의 80-100 mL를 가진 용기에서 세척 단계를 수행: 1차 항체에 대해 10 분 헹구고 이차 항체에 대해 6 배 헹구는 다.
      참고: 10% IRE 용액으로 희석된 1차 및 이차 항체 는 감도6의손실 없이 최대 8-10회까지 사용할 수 있다. 용액은 최대 1 개월 동안 4 °C로 유지해야합니다.

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결과

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이 예는 서쪽 블롯에 면역 강화 기술과 함께 CDR 방법의 효과를 보여줍니다. 정적 배큐베이는 PVDF 멤브레인이 항체 용액으로 배양된 반투명 플렉시블 필름에서 수행되었으며, CDR 인큐베이션은 막과 항체 용액(Movie)을 포함하는 튜브를 회전시켜 혼성화 오븐에 있었다. 도 2는 서쪽 얼룩에 화학 발광 검출에 필요한 각각 항원 및 항체의 양을 보였다. 정적 및 CDR 인큐베이션 모두에서 IRE 용액의 사용은 감도를 증가시켰습니다: IRE는 정적 조건하에서 2.2 μg에서 1.1 μg로 ß-actin을 검출하는 데 필요한 가장 낮은 수량의 세포 용액(항원)을 감소시키고 CDR(그림2A)을사용하여 1.1 μg에서 0.275 μg로 더 감소했습니다. 유사하게, 안티-6x의 최소 농도는 정적인 조건하에서 100 ng/mL에서 50 ng/mL로, CDR 조건하에서 100 ng/mL에서 12.5 ng/mL로 낮췄다(그림

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토론

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웨스턴 블롯은 40년 전 ~40년 전에 개발된 특정 단백질을 검출하기 위해 널리 사용되는 분석 기법으로7,8. 그이후로, 기술은 기술2,9,10,11,12,13의감도, 속도 및 양을 향상시키는 후속 혁신과 함께 진화를 계속하고있다. 여기에 제시된 향상된 초고속 웨스턴 블로팅 프로토콜은 기존 기술을 몇 가지 크게 향상시킵니다. IRE를 통해 검출 임계값을 낮춤으로써 감도를 희생하지 않고 인큐베이션 시간을 단축합니다. 특수하거나 비싼 장비가 필요하지 않습니다 : 하이브리드 화 오...

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공개 사항

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저자는 이 문서의 내용과 직접적인 관련이 있는 경쟁적 이해관계를 선언하지 않았습니다.

감사의 글

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이 연구는 교내 연구, 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소, 건강의 국립 연구소의 부서에 의해 지원되었다. S.H.는 일본 공립-민간 파트너십 학생 유학 유학 프로그램의 지원을 받았으며, H.N.과 K.Y.는 용맹및 V.Drug 해외 연수 장학금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14 mL 둥근 바닥 높은 선명도 PP 시험관, 눈금, 스냅 캡 포함Falcon352059
레이저 프린터 용 Apollo 투명 필름N / AN /A 모든 종류의 레이저 프린터 투명 필름은 괜찮습니다.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600모든 종류의 Image Acquiring System은 화학발광 및/또는 형광 검출에 적합합니다.
신호 면역 반응 증강 용액을 얻을 수 있습니다TOYOBONKB-101
카네이션 인스턴트 무 지방 분유카네이션N / A
ECL 안티 마우스 IgG, 양 고추 냉이 과산화 효소 연결 F (ab ')양의 단편2개 GE HealthcareNA9310V
ECL 항토끼 IgG, 양고추냉이 과산화효소 연결 F(ab')당나귀GE 헬스케어NA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/A수평 위치에서 균일하게 회전하는 한 모든 혼성화 오븐은 괜찮습니다.
Immobilon-P PVDF 멤브레인, 0.45 &마이크로; m 기공 크기Millipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD 염소 항 마우스 IgG 2 차 항체LICOR926-68070
IRDye 800CW 염소 항 토끼 IgG 2 차 항체LICOR926-32211
KPL LumiGLO 예비 화학 발광 기질seracare5430-0049
마우스 anti-ß 액틴 항체Millipore SigmaA5316
오디세이 차단 버퍼(PBS)LICOR927-40100형광 감지용 차단 버퍼
OXO 샐러드 스피너OXO32480V2BPVDF 멤브레인이 찢어지지 않고 세게 헹구는 한 모든 샐러드 스피너는 괜찮습니다.
파라 필름 밀봉 필름베미스파라 필름 M PM996반투명 플렉시블 필름
폴리에틸렌 플랫 탑 스크류 캡 50 mL 원추형 바닥 원심 분리기 튜브Falcon352070
50 ml 튜브 중앙에 14 ml 튜브를 고정하는 링N / AN / A기계 공장에서 준비
토끼 안티 6X 그의 태그 항체Abcamab9108
Tween20밀리포어 시그마P2287
튜브가

참고문헌

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  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

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