용해성 세포외 기질(ECM) 생산을 위한 인간 췌장의 세제 없는 탈세포화

요약

이 원고에 기술된 프로토콜은 인간의 췌장에서 용해성 세포외 기질(ECM)을 형성하는 단계를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 얻어진 가용화된 ECM 분말은 췌장도의 미세환경을 시험관 내 및 잠재적으로 생체 내 환경에서 재현하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

섬 이식(Islet Transplantation, ITx)은 베타 세포 대체 의학의 표준 치료법이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있지만, 그 결과는 전체 췌장 이식으로 얻을 수 있는 것보다 열등합니다. 현재 인간 섬 격리에 사용되는 프로토콜은 췌장이 파괴되고 신체와의 연결이 끊어지며 섬이 돌이킬 수 없게 손상되는 기관의 효소 소화를 기반으로 하기 때문에 정밀 조사가 진행 중입니다. 섬 손상은 섬 틈새의 3D 프레임워크를 나타내고 그 손실이 섬 진생리학과 양립할 수 없는 세포외 기질(ECM)의 파괴와 같은 중요한 요인을 특징으로 합니다. 연구자들은 이 문제를 해결하고 궁극적으로 섬의 생존력, 기능 및 수명을 개선하기 위해 포유류 췌장에서 파생된 ECM 기반 골격의 사용을 제안하고 있습니다. 이러한 스캐폴드를 얻기 위해 현재 사용 가능한 방법은 대부분 세제 기반이기 때문에 가혹합니다. 따라서 우리는 ECM 손상을 줄이고 췌장 ECM의 중요한 구성 요소를 보존할 수 있는 세제가 없는 새로운 방법을 제안합니다. 결과는 새로 개발된 탈세포화 프로토콜이 ECM 구성 요소가 유지된 상태에서 완전한 DNA 제거를 달성할 수 있음을 보여줍니다. 얻어진 ECM은 세포 독성에 대해 테스트되었으며 포도당 챌린지로 자극되었을 때 인슐린 분비와 함께 긍정적인 세포 거동을 보인 인간 췌장 섬으로 캡슐화되었습니다. 총체적으로, 우리는 기존의 이온 및 비이온 화학 세제를 사용하지 않고 인간 췌장의 탈세포화를 위한 새로운 방법을 제안합니다. 이 프로토콜과 함께 얻은 ECM은 in vitro 및 in vivo 애플리케이션 모두에 사용할 수 있습니다.

서론

췌장섬의 분리는 섬과 췌장섬의 세포외 주변 지지 구조 사이의 연결을 효소 분해를 통해 수행되는 세심한 과정입니다. 이러한 세포외 기질(ECM)의 파괴는 격리 과정에서 발생하는 섬의 손상을 특성화하는 데 중요한 요인 중 하나입니다 1,2,3,4. peri-islet ECM은 내분비 췌장의 필수 무세포 구성 요소입니다. 그것은 단백질과 다당류로 구성되어 있으며, 상호 작용하고 가교하여 구조적으로나 생화학적으로 생리학적 항상성을 지원하는 3차원 그물을 형성하고 이 체외 미세환경의 재현을 돕습니다 ^2,5,6. 섬과 ECM 사이의 근본적인 신호 전달 과정의 손실은 시험관 내 및 생체 내 섬의 생존을 제한하는 기여 요인 중 하나로 인식되고 있습니다 ^2,7,8,9,10.

동물 및 인간 유래 ECM은 췌장 섬의 미세 환경 11,12,13,14,15,16,17,18,19의 재현에 널리 사용되었습니다. 쥐섬 세포의 부착, 증식 및 장기 배양 유지를 향상시키는 ECM의 능력이 ^ref.20에서 처음 보고된 이후, 다른 많은 연구에서 인간 섬과 네이티브 ECM 상호 작용의 복원이 섬 기능을 향상시킨다는 강력한 증거를 제공했습니다^21,22. 예를 들어, 최근 데이터에 따르면 ECM으로 캡슐화된 섬은 당뇨병 마우스의 혈당 조절을 크게 개선하여 새로운 세포 기반 인슐린 전달 플랫폼에서 인슐린 전달을 강화하고 촉진하는 것으로 나타났습니다²³. 또한, 연구에 따르면 췌장 ECM의 중요한 구성 요소를 통합하면 β 세포 ^24,25,26,27의 내분비 기능을 크게 향상시킬 수 있습니다.

문헌에 나타난 ECM 제조 프로토콜은 Triton X-100 또는 도데실황산나트륨(SDS)과 같은 화학 세제의 적용을 기반으로 합니다. 우수한 DNA clearance를 제공함에도 불구하고 탈세포화 과정에 사용되는 화학 물질은 세포 독성이 있고 비용이 많이 들며 탈세포화된 조직의 잔류물은 잠재적인 임상 적용에 대한 우려를 불러일으킵니다.

이러한 관찰을 바탕으로 이 연구의 목적은 세 가지였습니다: 첫째, 이온 또는 비이온 화학 세제를 최소한으로 사용하여 인간 췌장에 대한 탈세포화 방법을 개발합니다. 둘째, 조직 배양을 위한 용해성 ECM 스캐폴드를 생산하는 것; 셋째, 세포 독성과 섬 세포 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해 췌장 ECM을 특성화합니다. 특성화는 모든 세포 배양 기반 응용 분야에 필요하며, 이는 용해된 췌장 ECM이 고립된 섬에 대한 췌장 미세환경을 재현하는 데 도움이 될 수 있음을 보여주기 때문입니다. 본원에는 인간 췌장에 대한 효과적이고 세제가 없는 탈세포화 방법, ECM의 특성화, 및 캡슐화된 분리된 인간 췌장섬의 생존력 및 기능에 대한 ECM의 영향이 설명되어 있습니다.

프로토콜

이 연구는 웨이크 포레스트 침례 의료 센터(Wake Forest Baptist Medical Center)의 인간 연구 위원회의 승인을 받았습니다. 인간 췌장은 Carolina Donor Services를 통해 장기 기증자로부터 윤리적으로 획득했습니다. 장기 기증자는 UNOS 규정에 따라 인간과 관련된 전염병에 대해 선별 검사를 받았다. 장기는 멸균 보존 용액에 넣어 사용할 때까지 보관되었습니다. 실험실로 이송된 후 모든 장기를 검사하고 조직학적 목적으로 천연 췌장 샘플을 수집했습니다. 그런 다음 장기를 동결하고 더 사용할 때까지 -20°C의 멸균 상태로 보관했습니다.

1. 인간 췌장의 외과적 준비

참고: 냉동 췌장은 4°C에서 밤새 해동했습니다.

1. 인간 췌장의 외과적 박리를 시작하기 전에 950mL의 탈이온수(dH_2O), 50mL의 요오드 기반 시약 및 1% Pen/Strep 용액으로 구성된 1L의 세척 용액을 준비합니다.
2. 외과 해부 중에는 멸균 장갑과 실험복을 착용하십시오. 오염 가능성을 방지하기 위해 세포 배양 등급의 후드 아래에서 모든 수술을 수행하십시오.
3. 멸균 운송 백에서 췌장을 멸균 태반 대야로 옮깁니다. 췌장이 장기의 머리가 왼쪽, 꼬리가 오른쪽을 향하도록 합니다.
4. 멸균 가위와 이가 없는 집게를 사용하여 췌장 머리에서 십이지장을 조심스럽게 해부합니다. 십이지장에 구멍을 뚫으면 오염 가능성이 높아지므로 주의하세요.
   알림: 위장관에 구멍이 생기면 빨리 clamp구멍을 뚫고 해부를 진행하십시오.
5. 췌장 머리 절개가 완료되면 십이지장을 적절한 생물학적 위험 백에 처분하고 폐기에 대한 제도적 지침을 따릅니다.
6. 주요 혈관과 총담관을 포함하여 췌장 머리 주변에 남아 있는 모든 췌장 외 조직을 절개하고 폐기하며, 이는 일반적으로 장기 조달 시 흡수되지 않는 봉합사로 표시됩니다. 기관 지침에 따라 조직을 폐기하십시오.
7. 췌장 꼬리를 둘러싼 모든 췌장 외 조직과 췌장 주위 지방 조직을 절개하고 폐기하여 비장 혈관을 노출시킵니다.
8. 비장의 혈관 척추경이 노출되면 비장을 제거하고 췌장의 뒤쪽 표면(비장 동맥 및 정맥)에 부착된 혈관을 포함하여 비장 혈관 전체를 절개합니다. 비장을 폐기하고 기관 지침에 따라 조직을 제거합니다.
9. 명확하게 보이는 췌장 외 지방, 특히 췌장 주위 지방을 적절하게 해부하고 폐기합니다.
   참고: 췌장의 꼬리 높이에서 후복막이 보일 수 있습니다. 이것은 톱니가 없는 집게로 들어 올리고 그에 따라 수술 집게로 제거하고 적절하게 폐기해야 합니다. 이제 췌장에는 췌장 외 조직이 없어야 합니다.
10. 췌장을 절개하여 수술용 가위, 멸균된 조직학적 칼날 또는 수술용 메스를 사용하여 췌장 조직^{1cm 3} 입방체를 얻습니다. 이 해부 후 얻은 췌장 조직 큐브는 탈세포화 과정을 거칠 것입니다. 탈세포화를 겪는 췌장 입방체의 평균 수는 장기의 고유한 특성에 따라 다릅니다. 제시된 연구에서 평균적으로 40-60개의 췌장 입방체가 탈세포화를 겪었습니다.
11. 2.1단계로 진행합니다.

2. 췌장 조직의 탈세포화(Decellularization)

참고: 이 프로토콜은 평균 체중이 100g인 췌장에 사용되었습니다. 따라서 이 탈세포화 기술을 사용할 때 이 무게를 초과하는 것은 권장되지 않습니다.

1. 1.10단계에서 이전에 절개한 모든 췌장 조직을 세척액과 함께 멸균 플라스틱 용기( 재료 표 참조)에 넣고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
2. 멸균 집게를 사용하여 췌장 조직을 제거하고 멸균되고 내독소가 없는 탈이온수가 들어 있는 새 멸균 용기에 넣습니다. 용기의 뚜껑을 단단히 닫고 4°C의 설정 온도와 180시간 동안 200–24rpm 사이의 쉐이킹 속도의 냉장 오비탈 셰이커에 놓습니다.
3. 췌장 조직이 있는 용기를 제거하고 외부를 적절하게 청소한 후 후드에 넣기 전에 프로세스를 계속하십시오.
4. 수술용 겸자를 사용하여 췌장 조직을 제거하고 탈이온수 1L, DNase I 50mg 및 염화마그네슘 0.0025%와 함께 새 멸균 용기에 넣습니다. 용기의 뚜껑을 단단히 닫고 사전 설정된 온도 37°C와 100rpm의 쉐이킹 속도로 6시간 동안 오비탈 셰이커에 넣습니다.
5. EDTA-Trizma 솔루션 준비
   1. 새 멸균 1L 용기를 모아 후드에 넣기 전에 적절하게 청소하십시오. EDTA-Trizma 용액 1L를 준비하려면 멸균 탈이온수 985mL, Tris-HCl 완충액 7.5mL 및 EDTA 용액 7.5mL를 추가합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
6. 췌장 조직을 둘러싸고 있는 용기를 제거하고 외부를 적절하게 청소한 후 후드에 삽입하여 프로세스를 계속하십시오.
7. 수술 겸자를 사용하여 췌장 조직을 제거하고 1L의 EDTA-Trizma 기반 용액이 들어 있는 새 멸균 용기에 넣습니다. 용기의 뚜껑을 단단히 닫고 사전 설정된 온도 4°C와 180시간 동안 200–18rpm 사이의 쉐이킹 속도로 궤도 셰이커에 넣습니다.
8. 췌장 조직이 들어 있는 용기를 제거하고 프로세스를 위해 후드에 넣기 전에 외부를 적절하게 청소하십시오.
9. 멸균 집게를 사용하여 췌장 조직을 제거하고 멸균 내독소가 없는 탈이온수가 담긴 새 멸균 용기에 넣습니다. 용기의 뚜껑을 단단히 닫고 4°C의 설정 온도와 180에서 200rpm 사이의 쉐이킹 속도로 24시간 동안 냉장 궤도 셰이커에 놓습니다.
   참고: 이 처리 기간 동안 눈에 띄는 색상 변화가 있어 조직이 더 밝게 보입니다.
10. 췌장 조직을 수집하여 멸균 50mL 원심분리 튜브에 보관하며, 후속 동결 및 동결 건조를 위해 튜브당 최대 25mL에 도달합니다. 원심분리 튜브의 수는 췌장의 크기에 따라 다릅니다. -80 °C에서 샘플을 보관하십시오.

3. 췌장 ECM 분말 생산 – 동결 건조 및 극저온 밀링

1. -80 °C에서 탈세포화된 물질을 최소 24-40시간 동안 보관한 후 췌장 ECM을 동결 건조기로 옮깁니다.
2. 얼어붙은 재료를 동결 건조기로 옮겨 재료가 해동되는 것을 방지합니다.
   참고: 동결 건조 단계는 공정을 거치는 각 튜브의 재료의 양 및 동결 건조를 위해 노출된 표면과 같은 여러 요인에 따라 약 3-5일이 소요됩니다. 탈세포화된 조직은 각 튜브에서 25mL 수준을 초과하지 않는 것이 좋으며, 동결건조가 시작되면 더 많은 표면이 쉽게 노출될 수 있도록 튜브를 45° 각도로 동결하는 것이 좋습니다. 튜브에서 뚜껑을 제거합니다.
3. 동결 건조 후 재료를 세포 배양 등급 후드로 옮깁니다.
4. 멸균 가위를 사용하여 건조된 ECM의 각 조각을 크기의 절반으로 자릅니다. 이 건조된 ECM 조각은 ECM 분말을 생산하기 위해 자동화된 밀링 공정을 거칩니다. 극저온 밀링된 자동 프로세서를 사용하여 온도 상승과 그에 따른 ECM의 생물학적 특성의 변성을 방지하십시오. 밀링 공정 후 미세한 분말을 얻을 수 있도록 크라이오 밀링 머신의 설정을 조정하십시오.
   참고: 이 연구에서는 BMI가 30인 기증자의 췌장< 사용되었습니다. BMI가 30>인 기증자의 췌장은 실질내 지방을 더 많이 함유하는 경향을 보였다. 동결 건조 과정은 최적의 것으로 간주되지 않으며 지방 함량에 의해 억제될 수 있습니다. 동결건조 후 조직이 눈에 띄게 유분해지면 ECM 분말 제조에 최적이 아니므로 폐기해야 합니다.

4. 췌장 ECM의 가용화

참고: 이 시점에서 평균 크기의 췌장(100g)에서 탈세포화된 췌장 분말의 수율은 1-2g입니다.

1. 멸균 플라스틱 주걱을 사용하여 ECM 분말 1g의 무게를 잰다.
2. 앞서 설명한 프로토콜에 따라 가용화를 달성합니다: 100mL의 0.01M HCl에 ECM 1g과 100mg의 펩신을 일정한 교반으로 48시간 동안 가용화합니다²⁸.
3. 48시간 후 NaOH를 사용하여 산성 ECM의 pH(pH = 7)를 중화하고 산성 ECM이 포함된 비커를 얼음 위에 두어 겔화를 방지합니다.
   참고: 겔화 역학은 온도, 콜라겐 함량, pH 및 중화 용액에 따라 다릅니다. 이 연구에서는 0.01M의 NaOH가 사용되었습니다. pH 중화를 위해 첨가된 NaOH의 부피는 약 100mL였습니다. 산성 ECM 용액을 중화하는 동안 pH를 여러 번 측정하는 것이 좋습니다.
4. 중성 ECM 용액을 멸균 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 튜브를 닫고 원심분리기에 넣습니다. 가용화된 ECM이 들어 있는 튜브를 4°C에서 15분 동안 최대 속도(12,000 x g)로 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브를 세포 배양 후드로 옮깁니다.
   참고: 샘플의 원심분리 후 ECM의 불용성 성분은 튜브 바닥에 증착되고 용해된 ECM 용액은 상등액의 상단에 있습니다.
5. 멸균 기술을 사용하여 용해된 ECM 용액이 들어 있는 튜브의 상층액을 수집하여 튜브당 최대 25mL에 도달하는 새 50mL 튜브로 옮깁니다.
6. ECM 용액 튜브를 -80°C에서 보관하십시오.

5. 췌장 ECM 분말의 생산 – 동결 건조 및 저장

1. -80 °C에서 용해성 ECM 용액을 최소 24-40시간 동안 보관한 후 튜브를 동결 건조기로 옮깁니다.
2. 얼어붙은 재료를 동결 건조기로 옮겨 재료가 해동되지 않도록 합니다.
   참고: 동결 건조 단계는 공정을 거치는 각 튜브의 재료의 양 및 동결 건조를 위해 노출된 표면과 같은 여러 요인에 따라 약 3-5일이 소요됩니다. 가용화된 ECM 용액은 각 튜브에서 25mL 수준을 초과하지 않는 것이 좋으며, 동결 건조가 시작되면 더 많은 표면이 쉽게 노출될 수 있도록 튜브를 45° 각도로 동결하는 것이 좋습니다. 동결 건조 전에 매 튜브에서 뚜껑을 제거하십시오.
3. 용해된 ECM 용액의 동결 건조 후 물질을 세포 배양 등급 후드로 옮깁니다. 완전한 동결 건조 후 미세한 ECM 분말이 보입니다.
   참고: 얻어진 수율은 탈세포화된 조직 1g에서 700mg입니다.
4. 가용화된 ECM 분말을 보관하거나 세포 배양 목적으로 사용하십시오.
   알림: ECM은 즉시 사용을 위해 4°C, 나중에 사용할 경우 -20°C, 장기 보관을 위해 -80°C에 보관하는 것이 좋습니다.

6. 조직학적 염색을 통한 췌장 ECM의 특성화

1. 장기 분만 직후와 탈세포화 직전에 천연 췌장 조각을 수집합니다. 10% 포르말린으로 24시간 동안 이것을 수정하십시오. 샘플을 탈이온수로 씻으십시오. 파라핀에 넣기 전에 등급이 매겨진 알코올로 탈수하고 5mm 섹션으로 자릅니다.
2. 탈세포화 과정이 끝나면 탈세포화된 물질의 샘플을 채취하여 10% 포르말린에 24시간 동안 고정합니다. 샘플을 탈이온수로 세척하십시오. 파라핀에 넣기 전에 등급이 매겨진 알코올로 탈수하고 5mm 섹션으로 자릅니다.
3. 성공적인 탈세포화를 확인하려면 천연 췌장과 탈세포화된 췌장 모두에 대해 H&E 및 DAPI 염색을 수행합니다.
4. 조직학적 특성 분석을 위해 Masson의 Trichrome(MT) 및 Alcian Blue(AB) 염색을 수행하여 각각 콜라겐 및 GAG 구조를 강조합니다.

7. 녹는 ECM 분말의 특성

1. 앞서 설명한 바와 같이 천연 췌장 조직과 용해성 ECM 분말의 DNA 함량 및 총 콜라겐 분석을 수행합니다²⁹.
2. 시판되는 키트에서 제공하는 프로토콜을 기반으로 황산화 글리코사미노글리칸(sGAG)을 정량화합니다( 재료 표 참조). 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595nm³⁰의 파장에서 췌장 ECM의 황산화 sGAG 함량을 측정합니다.
   참고: DNA 함량은 건조 조직의 ng/mg로, 콜라겐 및 GAG 함량은 건조 조직의 μg/mg으로 보고합니다.

8. ECM 및 문화를 가진 인간 섬 캡슐에 넣기

참고: Human pancreatic Islets는 상업적으로 획득되었습니다( 재료 표 참조).

1. 도착 시, 각 10cm 플레이트에서 약 2,000 IEQ의 밀도로 표준 조건에서 24시간 동안 비조직 배양 처리된 플레이트에서 인간 췌장섬을 배양합니다.
2. 다음 실험 그룹(Free Islets, alginate에 캡슐화된 Islets, alginate-ECM에 캡슐화된 Islets)을 사용하여 인간 섬을 조작하여 섬의 기능과 생존력에 대한 ECM의 효과를 테스트합니다.
   참고: 위에서 언급한 섬 그룹은 ECM이 섬의 기능 및 생존력에 미치는 영향을 평가하기 위해 최대 8일 동안 표준 조건에서 시험관 내에서 배양했습니다.
3. 알긴산을 저울로 칭량하고 HBSS와 함께 원심분리 튜브에 매달아 1.5%(w/v)의 비율을 얻습니다. 원심분리기 튜브를 4°C에서 밤새 회전기에 놓습니다.
   참고 : 75-200 kDA 사이의 분자량과 ≤ 1의 G / M 비율이 알긴산에 대한 제조업체에서보고되었습니다.
4. ECM 농도 0.1mg을 측정하고 ECM 농도 0.1mg/mL를 갖기 위해 미리 준비한 알긴산 1mL에 현탁합니다.
5. 앞서 설명한 프로토콜³¹에 따라 인간 췌장섬을 알긴산(alginate) 및 알긴산-ECM(alginate-ECM)으로 캡슐화합니다. 절차는 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
   1. 8.4단계에서 이전에 준비한 0.1mg/mL의 ECM 농도로 알긴산 1mL에 3,000 IEQ와 알긴산-ECM 1mL에 3,000 IEQ를 부드럽게 수집하고 혼합합니다.
   2. 얻어진 현탁액을 0.2mL/분으로 설정하고 유속 및 공기 압력이 각각 2.0Pa로 설정된 미세유체 캡슐화 장치를 통해 펌핑합니다.
   3. 생산 시 10mM의 HEPES와 함께 100mM의 CaCl₂ 수조에 마이크로캡슐을 수집합니다. 알긴산이 10분 동안 가교 결합되도록 합니다.
   4. 배양하기 전에 캡슐화된 섬을 표준 조건에서 37°C에서 5% CO₂로 2-3분 동안 HBSS로 세척합니다.
   5. 배양 배지를 추가하고( 재료 표 참조) 실험이 끝날 때까지 격일로 배지의 2/3를 교체합니다.
      참고: 위의 단계는 alginate의 Islets와 alginate-ECM의 Islets에 대해 모두 수행해야 합니다.
6. 캡슐화 후 8일째에는 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 및 DNA 분석을 수행하여 각각 인슐린 생산과 섬의 생존력을 평가합니다.
7. 명시야 이미지와 자유 섬 및 캡슐화된 섬의 Live/Dead 염색을 획득하여 세포 형태와 생존력을 평가합니다.
   참고: 섬의 건강을 평가하기 위해 이미지에 대한 질적 평가가 수행되었습니다. 고려되는 매개변수에는 섬의 모양, 경계, 무결성 및 직경뿐만 아니라 배양 중 단일 세포의 존재 여부가 포함됩니다.

9. 포도당 자극 인슐린 방출(GSIS) 및 DNA 측정

참고: 캡슐화 후 8일째에 인간 췌장섬을 수집하여 낮은(2.8mM) 포도당 농도와 높은(16.8mM) 포도당 농도를 함유한 Kreb's buffer로 배양한 다음 KCl 탈분극 용액(25mM)을 배양했습니다. 포도당 챌린지는 앞서 설명한 프로토콜을 수정하여 수행하였다³².

1. 폴리프로필렌 컬럼에 겔 여과 수지를 삽입합니다.
2. 폴리프로필렌 컬럼 내 겔 여과 수지의 중간 부분에 처리 그룹(free islets 또는 encapsulated islets)을 삽입합니다.
3. 포도당 및 탈분극 용액을 위에서 설명한 폴리프로필렌 컬럼에 피펫팅하고 다음 순서로 1시간 동안 배양합니다: 낮은 몰 농도 포도당 용액으로 사전 배양 기간을 수행한 다음 섹션 9의 시작 부분에 있는 NOTE에 언급된 대로 저농도, 고농도, 저분극 및 탈분극 포도당 용액으로 일련의 배양을 진행합니다.
4. 각 배양 단계에서 배지를 수집하고 후속 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
5. 탈분극 용액의 배양 및 수집 후, 인간 췌장섬에 1mL의 DNA 추출 버퍼를 배양하고 추가 분석이 있을 때까지 보관합니다.
6. 제조업체의 프로토콜에 따라 Insulin ELISA assay를 사용하여 포도당 및 탈분극 용액 배양에서 인슐린 함량을 측정합니다.
7. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 분석 키트를 사용하여 9.5단계에서 수집된 추출 버퍼의 DNA 함량을 측정합니다.
8. DNA 함량에 따라 인슐린 측정을 정규화합니다.

10. 통계 분석

참고: 그룹 비교는 이 원고에 설명된 각 분석에 대해 수행된 n = 3개의 독립적인 평가가 있는 동일한 배치의 인간 섬을 나타냅니다. 값은 평균 ± SD로 표현됩니다.

1. 통계 소프트웨어를 사용하여 탈세포화 및 DNA 잔여물 분석을 평가하기 위한 Mann-Whitney 테스트를 수행하고 네이티브, 탈세포화된 췌장 및 가용화된 ECM을 비교합니다.
2. native, decellularized pancreas 및 solubilized ECM 사이의 glycosaminoglycans 및 collagen 평가를 위해 unpaired t-test를 수행합니다.
3. 8일째에 섬 자극을 평가하기 위해 포도당 자극 테스트(Glucose Stimulation Test)에 대한 터키 후의 다중 비교를 사용하여 2-way ANOVA를 수행합니다.
4. p < 0.05에서 *p < 0.05, **p<0.01, ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001로 지정하여 통계적 유의성을 고려합니다.

결과

천연 및 무세포 췌장 샘플을 H&E, MT 및 AB로 조직학적 염색을 위해 처리했습니다. H&E 염색은 핵 물질과 세포가 전혀 없음을 보여주어 성공적인 탈세포화를 확인했습니다. MT 및 AB 염색은 ECM의 골격을 보여주었으며, 각각 질적으로 콜라겐 및 기질 성분을 강조했습니다(그림 1).

이 방법을 통해 인간의 췌장에서 ECM 분말을 일관되게 생성할 수 있었습니다. DNA 정량화 검사에서 만족스러운 세포 제거율이 확인되었습니다³³. 천연, 무세포 및 가용화된 췌장 ECM은 기본적인 생물학적 조성을 평가하기 위해 생화학적으로 특성화되었습니다. 췌장 ECM은 무세포 및 DNA가 없는 것으로 확인되었으며(건조 조직의 DNA < 50 ^ng.mg-1), 다른 사람들에 의해 보고된 바와 같이 콜라겐과 글리코사미노글리칸이 일관되게 보존되었습니다

토론

이 연구의 목적은 췌장 ECM을 생성하기 위해 보다 부드럽고 세제가 없는 탈세포화 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 췌장 실질의 ECM 구성 요소를 보존하고 탈세포화 과정에서 기존의 이온 또는 비이온 화학 세제에 대한 긴 조직 노출을 피하는 데 주의를 기울였습니다.

개발된 탈세포화 방법의 가장 혁신적인 측면은 고전적인 이온 및 비이온 화학 세제를 피하는 것입니다. 인간 췌장 ECM 11,12,13,22,34,35 생산에 대한 이전 경험은 무세포 췌장 지지 배지 생산의 기준선을 설정했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
코닝 1L 이지 그립 폴리스티렌 저장 병 45mm 캡	ThermoFisher 430518		탈세포화에 용기 사용
극저온 밀	SPEX Certiprep	6870-230
소 췌장에서 Deoxyribonuclease I	시그마 Aldrich	DN25
증류수	ThermoFisher	15230147
Falcon 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브	Corning	352070
췌
-Elisa	Mercodia	10-1113-01
염화마그네슘, 1M, 멸균	Bio-World	41320004-1
돼지 위 점막의 펩신	Sigma Aldrich	P7012-5G
태반 분지(뚜껑 없음), 멸균	DeRoyal	32-881
폴리프레 크로마토그래피 튜브	Bio-rad	731-1500	폴리프로필렌 컬럼
Quant-iT, PicoGreen, dsDNA 분석 키트	, Invitrogen	P7589	DNA 키트
SamplePrep 대용량 냉동고/밀 액세서리,	SPEX	6801	대형 분쇄 바이알 세트
Sephadex G-10 비드,	Cytiva	17001001	젤, 여과 수지
UltraPur 0.5M EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575020
UltraPur 1M Tris-HCI 완충액, pH 7.5	ThermoFisher	15567027
UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	ThermoFisher	10977023