여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.
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이 논문에서
요약
초록
안구 표면은 한 번 면역 특권과 비생물으로 간주되었다, 하지만 최근에는 작지만 지속적인 막연한 막대한 존재가 있는 것으로 보인다. 안구 점막에서 세균 종의 식별 및 모니터링은 그들의 낮은 풍부와 인문 성장 및 식별을위한 적절한 방법론의 제한된 가용성으로 인해 도전하고있다. 문화 기반 또는 DNA 염기서열 분석 방법의 두 가지 표준 접근 법이 있습니다. 첫 번째 방법은 제한된 회수 가능한 박테리아로 인해 문제가 되고 두 번째 접근법은 안구 공간의 비정상적인 표현으로 이어지는 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 모두 식별합니다. 우리는 표준 미생물 배양 기술을 기반으로 세균 격리를 위한 견고하고 민감한 방법을 개발했습니다. 이것은 "실험실"이 낮은 결막을 대상으로 하는 얇은 면봉을 활용한 면봉 기반 기술이며, 그 다음으로 호기성 및 학부 해부학 적 제네라에 대한 증폭 단계가 뒤따릅니다. 이 프로토콜은 우리가 코린 박테리움 spp., Coagulase 네거티브 황색포도상구균 spp., 연쇄상 구균 spp등과 같은 결막 종을 분리하고 식별할 수 있게 했습니다. 접근은 다른 질병 조건의 마우스에 있는 막증을 정의하는 것이 적합합니다.
서론
이 프로토콜의 목적은 안구 내막 에서 실행 가능하고 희귀 한 호기성 및 학부 성 혐기성 미생물의 특정 절연을 강화하여 안구 미생물군유전체를 특성화하는 것입니다. 광범위한 연구는 피부, 창자, 호흡기 및 생식기에 대한 막수 점막 커뮤니티를 프로파일드하고 이러한 지역 사회가 면역 체계의 발달과 반응1,2,3에영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 안구 내문 공동체는 안구건조증4,쇼그렌 증후군5 및 당뇨병6과같은 특정 질환 병리학 중에 변화하는 것으로 나타났다. 그러나, 전형적인 안구 표면 발생 공동체를 정의하는 능력은 다른 점막부위에비해 상대적으로 낮은 풍요로움에 의해 방해된다6,7,8. 이것은 상주 안구 미생물군유전체가 있는지, 그리고 존재하는 경우에, 피부 microbiome와 다른지, 결과적으로, 타고난 면역 계통 발달 및 반응에 그것의 ....
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프로토콜
마우스와 관련된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침을 따릅니다. 미생물 및 잠재적으로 오염된 물질로 작업할 때 실험실 안전 지침(기관 환경 보건 및 안전 부서의 지시)을 따르십시오. 잠재적으로 생물학적 오염 물질을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 리셉터클 및 오염 제거 절차를 사용합니다.
1. 눈 면봉 준비, 작업 장 설정, 마우스 눈 면봉 및 샘플 농축
- 멸균 눈 면봉 준비
참고: 멸균 눈 면봉은 얇게 코팅 된 나무 이쑤시개와 면 의 섬유 얇은 층이 있는 집에서 만들어집니다.- 면봉을 할 수 있는 마우스 수에 대해 적절한 양의 면 타격과 이쑤시개를 자동 클랩합니다.
- 엄지와 집게 손가락으로 면 타격의 반 센티미터 길이조각을 꼬집습니다. 엄지와 앞손가락으로 가장자리를 당겨 평평한 단일 다공성 층을 형성하여 타격을 애타게하고, 타격이 무너지기 직전에 멈춥니다 (늘어난 타격에 분산 된 면의 작은 비트는 허용됩니다).
- 이쑤시개 끝에 늘어진 조각을 가볍게 잡고 이쑤시개 끝의 날카로운 끝 중 하나 주위의 타격을 소용돌이치며 그림 1을참조하십시오. "완성된" 눈 면봉은 팁 위에 뻗어 있는 매....
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결과
도금에 대한 다양한 방법을 보여주는 눈 면봉 판에 대한 대표적인 결과는 C57BL/6 마우스로부터 형태학적으로 다양한 분리를 보여주는 도 3A에 그려지고 있다. 각 뚜렷한 격리에 대해, 식민지는 스트립과 상대적 풍부, 눈 면봉 당 독특한 콜로니 형성 단위 (CfU)에 계산하고 비교 목적을 위해 플롯하였다. 미생물 특성화를 위해, 박테리아는 마스터 TSA 플레이트를 생산하기 위해 개별 마우스 눈 면봉 플레이트에서 수확되었다 (각 마우스 눈 면봉 플레이트에서 삼중 분리체에서 형태학적으로 뚜렷한 분리를 따기하여 생성). 마스터 플레이트에서, 후속 날 또는 성장이 나타날 때, 추가 테스트는 미생물을 특성화하거나 식별하기 위해 실행되었다. 마스터 플레이트는 각각의 분리를 확장하기에 충분한 접종을 제공하는 데 사용되었습니다.
종은 미생물학적 기술을 사용하여 특징지어졌으며 MALDI-TOF MS 분석에 의해 확인되었습니다. 각 분리판은 카.......
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토론
안구 표면의 파시균 상태로 인해 많은 실험실에서 안구 공생을 분리하는 데어려움이 있어7,20의성장, 낮은 풍부및 낮은 다양성8을가진 시료수가 적어집니다. 이 방법은 MALDI-TOF MS에 의한 재설계된 눈 면봉 및 식별뿐만 아니라 농축 단계의 첨가에 의해 표준 배양 관행4,21에 크게 향상됩니다. 농축 단계는 세균 부하를 증폭시켜 낮은 회수율을 해결합니다. 야생형 남성 마우스에 대한 눈당 2,500CFU의 상대적 풍부에 100 CFU 미만에서 회복 가능한 박테리아의 현저한 증가는 영양이 풍부한 매체의 배양이 실행 가능하지만 비 재배성박테리아(22,23)를재활성화시켜 휴면 미.......
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공개 사항
공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
P30 DK034854의 자금 지원VY, LB 및 매사추세츠 호스트-미생물군유전체 센터의 연구 및 NIH/NEI R01 EY022054의 자금 지원 MG.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1 내지 10 &마이크로; l 피펫 팁 | USA Scientific | 1110-300 | 사용 전 오토클레이브 |
| 0.5 to 10 µ l Eppendorf 피펫 | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml 주사기 | Fisher Scientific | BD309623 | 각 눈 면봉 그룹당 1 주사기 |
| 1.5 ml Eppendorf 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | 사용 전 오토클레이브 |
| 1000 &마이크로; ml 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-2021 | 사용 전 오토클레이브 |
| 200 to 1000µ l Gilson 피펫맨 (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25G 바늘 | Fisher Scientific | 14-826AA | 눈당 바늘 1개 면봉 그룹 |
| 3% 과산화수소 | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C 인큐베이터 | 실험실 장비 | ||
| 70 % 이소프로판올 | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
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참고문헌
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science
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