Quantification of Cerebral Perfusion using Laser Speckle Imaging(레이저 스페클 이미징을 사용한 대뇌 관류의 정량화) 및 MRI를 사용한 경색 용적량(Infarct Volume using MRI using MRI using Posterior Circulation Stroke)

요약

LVO 뇌졸중의 개 모델을 활용하여 뇌 관류를 실시간으로 모니터링하기 위한 레이저 스페클 이미징을 개발했습니다.  확산 가중 MRI는 높은 b-값을 활용하여 경색 볼륨을 이미지화하도록 최적화되어 뇌졸중 시 DSA와 상관관계가 있는 ADC 및 MRA를 가능하게 했습니다.  마지막으로, ADC 재구성은 조직학적 발견과 상관관계가 있습니다.

초록

배경: 기저동맥 폐색(BAO)은 사망률이 90%에 달하는 후순환 뇌졸중의 하위 집합입니다.  허혈성 뇌졸중을 진단하기 위한 현재 임상 표준에는 컴퓨터 단층 촬영(CT), CT 혈관 조영술 및 관류, 자기 공명 영상(MRI)이 포함됩니다. 임상질환을 정확하게 반영할 수 있는 대형동물의 전임상 모델과 뇌졸중 부담을 평가하고 치료법을 평가하는 방법은 부족하다.

방법: 우리는 후방 순환에서 LVO(Large Vessel Occlusion) 뇌졸중의 개 모델을 설명하고 관류 변화를 실시간으로 모니터링하기 위해 레이저 반점 이미징(LSI) 프로토콜을 개발했습니다.  그런 다음 감지 감도를 높이기 위해 높은 b-값 DWI(b=1800s/mm²) MRI를 활용했습니다. 또한 동맥 폐색을 평가하고 DSA와의 상관관계를 평가하는 자기공명혈관조영술(MRA)의 능력을 평가했습니다. 마지막으로, 조직학을 통한 ADC(Apparent Diffusion Coefficient) 매핑에서 경색 크기를 확인했습니다.

결과: 혈전색전증의 투여는 DSA에 의해 추적된 바와 같이 기저동맥을 폐색시켰다(n=7).   LSI는 DSA와 상관관계가 있었으며, 뇌졸중 발병 후 관류 감소가 실험 내내 지속되어 실시간으로 관류를 모니터링할 수 있었습니다.  반려견에 최적화된 B-값을 가진 DWI는 뇌졸중 부피를 설명하고 ADC 및 자기공명혈관조영술(MRA) 이미지를 도출할 수 있게 해주었습니다. 실험 종료 시 수행된 MRA는 폐색 후 수행된 DSA와 상관관계가 있었습니다. 마지막으로, MRI에 대한 뇌졸중 부담은 조직학과 상관관계가 있었다.

결론: 본 연구는 허혈성 뇌졸중의 진단 및 치료에 중요한 다중 모드 영상을 활용하는 후방 순환 뇌졸중의 개 혈전색전증 LVO 모델의 LSI를 사용한 실시간 관류 영상을 보여줍니다.

서론

전 세계적으로 뇌졸중 유병률은 약 2,570만 명이며, 그 중 대다수는 허혈성 질환이다¹.  후순환 뇌졸중은 모든 뇌졸중의 20%를 차지하며, 그 중 기저동맥 폐색이 가장 심하여 사망률의 90%에 육박합니다 ^1,2.  1995년, 재조합 조직 플라스미노겐 활성제(rtPA)는 뇌졸중 발병 후 3시간 이내에 내원한 환자를 대상으로 허혈성 뇌졸중을 치료하기 위해 개발된 최초의 급성 치료제였다³. 최근에는 기계적 혈전제거술이 내경동맥의 두개내 부분 또는 전뇌 및 중대뇌동맥의 첫 번째 분절을 포함하는 대혈관 폐색(LVO)이 있는 환자의 급성 허혈성 뇌졸중 치료에 도움이 되는 것으로 입증되었다⁴.  최근의 임상시험 중 후순환 뇌졸중은 포함되지 않았으며, 기저동맥 폐색에 기계적 혈전절제술을 사용했음에도 불구하고 그 결과는 여전히 암울하다: ^5,6.

뇌졸중 환자에 대한 평가 기법의 발전은 기능 회복 및 생존 가능성을 예측하는 데 영향을 미친다⁷. 후순환 뇌졸중의 전임상 모델은^{이전에 기술되어} 있지만^{, 8,9,10} 뇌졸중 부담과 혈관재생에 대한 평가는 여전히 차선책이다.  설치류와 같은 작은 종은 유전자 조작의 용이성, 저렴한 동물 구매, 낮은 일당 주택 비용 등 여러 가지 이점을 제공합니다^11,12. 그러나 소동물 실험은 때때로 대형 동물 및 인간의 혈관 구조, 생리학적 상태 또는 관련 염증 반응을 완전히 나타내지 못한다⁷. 대형 동물은 인간의 뇌졸중을 더 밀접하게 모방합니다 ^2,7,13,14.  또한 혈전성 및 염증 지표의 혈액 분석을 위해 연속 혈액 샘플링을 수행할 수 있습니다.

이 연구에서는 뇌졸중 발병 시점부터 디지털 감산 혈관 조영술(DSA)로 검증된 기저동맥 폐색의 개 모델을 설명합니다.  당사는 레이저 스페클 관류 이미징(LSI)을 활용하여 실시간으로 관류를 모니터링합니다.  그런 다음 레이저 스페클 관류 영상(LSI) 획득을 기반으로 하는 새로운 미세혈관 강화 알고리즘과 높은 b-값 자기 공명 영상(MRI) 기술을 활용하여 경색 영상을 최적화합니다¹⁵. 이러한 기술을 통해 국소 및 전 세계 허혈을 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 이러한 이미징 결과를 조직학과 연관시킵니다. 전임상 모델에서 후순환 뇌졸중의 예후를 이해하고 연구해야 할 필요성을 이해하는 것은 치료법을 개선하는 데 매우 중요합니다.

프로토콜

모든 절차는 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받은 동물 복지법 및 실험실 동물 관리 및 사용 지침(NRC 2011)에 따라 수행되었습니다.

1. 1단계: 동물 준비 및 수술 프로토콜 기저동맥 폐색(BAO) 뇌졸중의 개 모델을 앞서 설명한 대로 사용하였다 ^9,10.

1. 빠른 성인 비글 (8-13kg, 14-21 개월)은 하룻밤 동안 무료로 물을 이용할 수 있습니다.
2. 마취 전 아세프로마진(0.2 mg/kg)의 근육 투여 주사
3. 20게이지 카테터를 두부 정맥에 삽입합니다.
4. 케타민(10mg/kg)과 미다졸람(0.025mg/kg)의 정맥 투여로 마취를 유도합니다.
5. 마취 유도 후 개를 삽관하고 지속적인 흡입 마취(2-3% 이소플루란)를 사용하여 기계적으로 인공호흡을 합니다.
6. 레이저 스페클 이미징을 위한 1cm² 개두술 창을 만듭니다.
7. 접근 및 혈압 측정을 위해 오른쪽 대퇴 동맥에 7F 동맥초를 삽입합니다.
8. 채혈을 위해 16게이지 혈관 카테터를 오른쪽 대퇴 정맥에 삽입합니다.
9. 앞서 설명한 대로 혈전색전(혈전)을 준비한다¹⁶. 간단히 플라스틱 혈청 채혈 튜브에 송곳니 전혈 5mL와 황산바륨 0.5g(Ba₂SO₄)을 뽑아 30초 동안 굴리면서 혼합합니다. 카테터를 투여하기 전에 혼합물을 실온에서 60분 동안 방해받지 않고 휴지시킵니다.
10. 중간 기저 동맥에 접근하기 전에 기준선 디지털 감산 혈관 조영술(DSA)을 기록하기 시작합니다. 역행성 경대동맥 접근법을 사용하여 형광 투시 유도 하에 4F 안내 카테터를 척추 동맥을 통해 기저 동맥 기저부까지 오른쪽 대퇴 동맥에 이전에 배치된 7F 동맥초로 전진시킵니다. 기저동맥을 확인하기 위해 2ml의 조영제에 생리식염수를 주입합니다.
11. 수술용 메스를 사용하여 피브린이 풍부한 층과 적혈구가 풍부한 층(¹⁶ )을 가진 혈전을 작은 조각으로 절제하여 3mL 주사기에 넣고 마이크로 카테터를 통해 기저동맥 중앙으로 주입합니다. 혈전이 10분 동안 안정될 때까지 기다립니다. 원하는 혈전 위치를 확인하기 위해 후속 혈관 조영술을 수행합니다. 동맥 폐색은 DSA로 확인할 수 있으며 레이저 스페클 이미징(LSI)으로 대뇌 관류 감소를 확인할 수 있습니다.

2. 2단계 레이저 스페클 이미징

1. 레이저 스페클 관류 이미징(LSI) 카메라를 두개골 창에 초점을 맞춥니다. 앞서 설명한 바와 같이 고해상도 레이저 스페클 이미징(LSI) 카메라 시스템을 구성합니다¹⁵.
2. 원하는 시점에 혈관 조영술을 수행하는 동안 중단과 함께 관류를 기록합니다. 이 송곳니 모델에서 10cm의 working distance에서 60Hz의 샘플링 속도로 785nm 파장과 80mW 레이저를 사용하여 1.5cm x 1.5cm 시야에서 데이터를 수집합니다.
3. 실시간 관류 그래프에서 더 낮은 피크만 포함하도록 관심 시간(TOI)을 선택하고 호흡 모션 관련 아티팩트만 제외합니다. PimSoft v1.4 소프트웨어를 사용한 10초 샘플링 기간 동안의 평균 상대 관류 단위. 앞서 설명한 바와 같이 레이저 스페클 콘트라스트 분석(LASCA)을 수행한다¹⁵.
4. 이 개 모델에서 뇌 미세혈관 구조의 정량화를 최적화하려면 초당 15프레임으로 이미지를 기록하고 5프레임의 5 x 5 픽셀 영역에 대해 시공간 평균으로 강도 및 분산 계산을 수행합니다. 강도 및 분산 데이터의 전체 프레임 속도는 초당 3프레임이었습니다. 각 픽셀에 대한 관류의 중앙값을 선택하여 송곳니 호흡의 움직임으로 인한 관류 판독값의 큰 급격한 변화의 평균에 미치는 영향을 줄입니다. 원시 데이터를 이진 파일로 변환하고 데이터를 혈관 구조의 의미 있는 이미징으로 처리합니다. 프로그램 재도구화된 LASCA 알고리즘(rt-LASCA)을 활용하여 시간 경과에 따른 대비 데이터의 분산을 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 혈관 구조의 위치를 결정합니다¹⁵.

3. 3단계: 자기공명영상(MRI) 및 자기공명혈관조영술

1. 원하는 경우 비교를 위해 수술 전날 MRI를 실시한 다음 BAO를 확인하기 위해 반복하고 치료 약물을 평가해야 하는 경우 희생하기 전에 다시 수행합니다.
2. 이전에 설명한 바와 같이 지속적으로 마취된 송곳니를 누운 자세로 머리부터 먼저 놓습니다: Siemens Prisma 3 Tesla 전계 강도 및 60cm 직경의 보어 MRI 스캐너(수신기로 32채널 헤드 코일을 포함)는 뇌 이미지를 얻기 위해 향상된 병렬 이미징 성능을 제공합니다¹⁷.
3. 로컬라이저 스캔을 수행하여 해부학적 이미징이 시작되기 전에 각 개의 뇌에 대한 파일럿 이미지를 획득합니다.  제시된 데이터를 얻는 데 사용되는 시스템에는 최적의 공간 및 시간 해상도로 더 빠르게 스캔할 수 있는 통합 이미징 시스템이 있습니다. 80mT/m 그래디언트는 고품질 T2 가중치, 확산 가중치 이미지 및 MR 혈관조영술을 생성합니다. DWI(Diffusion-weighted imaging)는 충분히 민감하며 T2 가중 이미지와 같은 기존 구조 MRI 방법보다 더 많은 해부학적 하부 구조를 보여줄 수 있습니다. 이 연구에서 MRI는 BAO 후 4시간 후에 수행되었습니다.
4. 적절한 국소화 후 T2 가중치 그래디언트 에코 이미징(매개변수: FOV = 130mm, 매트릭스 크기 = 320 x 320, 픽셀 크기 = 0.3 x 0.3mm, 슬라이스 두께 = 3mm, TR= 4s, FA= 180도, BW = 255Hz/픽셀, NEX= 2, TE=75ms, 해상도= mm당 2.4615픽셀) 다음에 FLAIR(flow attenuated inversion recovery) 이미징을 수행하여 뇌 해부학의 구조를 시각화합니다.
5. 자기공명혈관조영술(MRA)을 수행하여 혈관 해부학 및 혈액 순환 측정을 시각화합니다. 가로 보기에서 TOF(Time-of-Flight-3D) 시퀀스로 머리와 목을 덮고 있는 뇌의 MRA를 획득합니다(매개변수: FOV = 129x129mm, 매트릭스 크기 = 768 x 768, 픽셀 크기 = 0.3 x 0.3mm, 슬라이스 두께 = 81.59mm, TR= 25ms, FA= 18도, BW = 185Hz/픽셀, NEX= 1, TE=4.22ms, 해상도 = mm당 5.91픽셀). 3D 색상으로 구분된 시각화를 통해 최대 강도 투영(MIP)을 수행하여 혈관의 신호 강도를 최대화합니다.  후처리는 혈관을 시각화하고 기저동맥이 막혔는지 확인하기 위해 DICOM 이미지를 획득했습니다.

4. Step 4: 확산 가중 이미징 및 스트로크 부피 계산

1. 급성 허혈성 뇌졸중(매개변수: FOV = 149mm x149mm, 매트릭스 크기 = 132 x0x0x 100, 픽셀 크기 = 0.30mm x 0.30mm, 슬라이스 두께 = 4mm, TR = 4.6s, FA = 90도, BW = 255Hz/픽셀, NEX= 1, TE = 86ms, 해상도= mm당 0.93픽셀)을 감지하기 위해 확산 가중 이미징 시퀀스를 수행합니다. 후처리를 위해 DICOM 이미지를 전송합니다.
2. DWI 이미지에서 ADC(Apparent Diffusion Map)를 생성하고 OsiriX MD v.5.0 소프트웨어를 사용하여 경색 부피를 계산합니다.
3. 슬라이스당 뇌 반구와 경색 영역을 모두 추적하고 슬라이스 두께를 곱하여 경색 부피를 구합니다.
4. 절대 전체 부피를 100 단위로 변환하여 각 송곳니의 퍼센트 스트로크 부피를 계산합니다.

5. 5단계: Hematoxylin 및 Eosin 염색, 뇌 조직학

1. 마취된 송곳니에서 희생 제물을 바칠 때 뇌를 적출하고 날카로운 메스로 4mm 두께의 두 개의 내측 부분을 자르고, 한 부분은 아래의 TTC 염색에 사용됩니다.
2. 4mm 부분을 10% 포르말린으로 최소 7일 동안 고정하여 전체 섹션에 침투할 수 있도록 합니다.
3. 프로토콜¹⁷에 따라 파라핀에 고정 뇌 섹션을 삽입하십시오.
4. 각 파라핀 블록을 자르고 수평을 맞춥니다(여러 블록을 동시에 저장하고 처리할 수 있음).
5. 각 파라핀 블록을 4μm로 절단하고 절단된 조직을 2" x 3" 인치 슬라이드에 놓습니다.
6. Hematoxylin 560에서 각 슬라이드를 8분 동안 처리하고 수돗물로 헹구면서 1초 동안 1% 산성 알코올로 3회 분화합니다.
7. 각 슬라이드에 1% 수산화암모늄을 1초 동안 파랗게 하고 수돗물로 2초 동안 헹굽니다.
8. 70% 에탄올에서 1초 동안 12회 탈수하고 1분 동안 에오신에서 대조염색합니다.
9. 95 % 1 회 12 회 탈수 한 다음 100 % 에탄올을 사용합니다.
10. 자일렌을 투명하게 하고 장착 매체와 함께 2" x 3" 인치 커버슬립을 적용하여 기포를 제거합니다.

6. 단계 6 : 2 % 2,3,5- 트리 페닐 테트라 솔륨 클로라이드 뇌 염색

1. H&E 섹션 옆에서 수확한 두 번째 4mm 섹션을 100mL, 2%, 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸륨 클로라이드(TTC)가 포함된 미리 준비된 용액에 넣고 pH 7.4PBS에서 어둠 속에서 37°C로 예열합니다.
2. 37°C의 어두운 곳에서 최소 20분 동안 배양하고 5분마다 뇌 부분을 부드럽게 뒤집습니다.
3. 단면이 양쪽에서 체리 레드로 변하면 TTC 용액을 제거하고 PBS, pH 7.4의 4% 파라포름알데히드로 교체하여 밤새 대비를 최적화합니다.
4. 뇌에서 흰색과 빨간색 염색의 대비가 최적일 때(1-3일), 투명한 플라스틱 시트 사이에 놓고 여분의 액체를 건조시킨 다음 고해상도로 스캔합니다.
5. 허혈 영역과 전체 뇌 슬라이드를 추적하여 앞서 설명한 대로 각 섹션의 경색 비율을 얻습니다¹⁷.

결과

Laser Speckle Perfusion 기록 및 이미징: 관류 기록은 동물을 MRI로 이송할 때까지 계속 수행되었고, 희생 시 다시 수행되었습니다(그림 1A). 데이터에 따르면 기저동맥 폐색(pre-BAO) 이전 시점에서 대뇌 관류가 ~15% 감소한 83 ± 10%를 기록했습니다. 이러한 명목상의 감소는 원위 척추 동맥에 미세 카테터를 삽입한 결과일 가능성이 높습니다. 제제 혈전색전을 주입한 후 BAO 후 관류는 평균 33 ± 2.6%로 떨어졌으며, 이는 기준선 대비 ~67% 감소를 나타냅니다(그림 1B). 혈관 조영술 관찰에 따르면 기저동맥의 혈액 순환은 BAO 이전에 특허였으며(그림 2A) 자가 혈전 투여 후 완전히 폐색되었습니다(그림 2B). 혈관 조영술과 일치하게, 두개골 창을...

토론

후순환 뇌졸중의 가장 흔한 원인으로는 색전증, 대동맥 죽상동맥경화증, 소동맥 질환^{등이 있다 5}. 기저 동맥 폐색(Basilar arterial occlusion, BAO)은 후순환 뇌졸중의 하위 집합으로, 상당한 이환율과 사망률을 수반한다¹³. 이러한 맥락에서 급성 후방 뇌졸중의 개 모델을 활용하고 폐색 부위의 관류를 실시간으로 모니터링할 수 있는 LSI 프로토콜을 개발했습니다. 레이저 스페클 관류 영상은 작은 두개골 창을 통해 수행되어 정의된 관심 영역에 대한 실시간 정보를 제공했습니다. 뇌졸중 발병 후 관류가 감소하여 실험이 끝날 때까지 지속되었습니다.  이 창은 혈전용해제제 또는 혈전제거술 장치 치료 후 관류 변화에 대한 실시간 정보를 제공할 수 있습니다.  두개골 창을 통해 LSI를 수행한 후, rt-LASCA 알고리즘¹⁵을 사용하여 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(PBS의 TTC, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin, 10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC 포지셔닝 시스템	DRE 수의학	1320
LabChart 소프트웨어	ADInstruments Inc.
레이저 스페클 이미징 카메라	Perimed Inc., Jarfalla, 스웨덴	PeriCam, PSI, HR 시스템
리튬 헤파린 진공 청소기, 4.5 %	Becton, Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD, v.5.0 소프트웨어	Pixmeo Inc, Geneva
PBS의 파라 포름 알데히드 4 %,	Alfa Aesar
PimSoft v1.4 소프트웨어	Perimed Inc.	LSI 장비
Prisma Fit 3 테슬라 (3T) 자석	Siemen's Diagnostics
주사용 헤파린나트륨(혈액 가스 주사기 코팅용)	NovaPlus	402525D