방법 논문

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds(보리 종자 개발에서 고순도 조직의 분리)

2.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

2020년 10월 26일

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 전체 보리 종자 발달 동안 배아, 배유 및 종자 모계 조직의 고순도 수동 분리 및 품질 관리를 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

곡물 종자의 발달을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 식물 육종과 수확량 증가에 필수적입니다. 그러나 곡물 씨앗의 분석은 미세한 크기, 일부 조직의 액체 특성, 긴밀한 조직 간 연결로 인해 어렵습니다. 여기에서는 보리 종자 발달의 초기, 중간 및 후기 단계에서 배아, 배유 및 종자 모계 조직을 해부하기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 정밀한 도구와 쌍안 현미경을 사용한 수동 조직 해부와 ploidy 분석 기반 순도 제어를 기반으로 합니다. 종자 모계 조직과 배아는 이배체이고 배유는 삼배체 조직입니다. 이를 통해 유세포 분석을 사용하여 시료 순도를 모니터링할 수 있습니다. 추가 측정은 이러한 샘플에서 분리된 RNA의 고품질과 고감도 분석에 유용성을 보여주었습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 재배된 보리 곡물과 잠재적으로 다른 곡물의 발달로부터 순수한 조직을 실질적으로 해부하는 방법을 설명합니다.

서론

씨앗은 모계와 효도에 기원한 여러 조직으로 구성된 복잡한 구조이다1. 곡물 알갱이는 특별한 유형의 씨앗을 대표하며, 가장 큰 부분은 배아를 보호하고 영양을 공급하는 특수 삼배체 조직인 배유에 의해 형성됩니다. 곡물은 전 세계 식량 자원의 약 60%를 제공하며 식물 생산에서 가장 가치 있는 생산물입니다2. 곡물 종자 발달을 제어하는 분자 과정에 대한 지식은 경제적 중요성과 식물 번식에서 중심적인 역할로 인해 중요합니다 1,3.

재배 보리(Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5.1 Gbp)는 전 세계에서 네 번째로 중요한 곡물 작물입니다. 동물 사료, 식품 및 생명 공학에 사용됩니다4. 그 외에, 그것은 또한 고전적 온대 지역 곡물 작물 모델 중요성이 증가하는 종입니다5. 보리 게놈 자원에는 유전자 지도, 품종 수집, 재래종 및 돌연변이, 고품질 게놈 어셈블리 및 주석, 주요 발달 단계의 전사체 데이터가 포함됩니다 5,6,7. 또한 보리 유전자는 다른 곡물의 유전적 개선에 사용됩니다. 보리는 가뭄과 염분과 같은 비생물적 스트레스에 대한 저항성, 특정 병원균, 유익한 화합물(예: β-글루칸)의 높은 함량으로 인해 밀 육종을 위한 귀중한 특성 공급원이 됩니다8.

종자 발달은 수분일(DOP)에 비료를 주어 시작됩니다. DOP는 Waddington 척도(W10.0)9에 따라 암술머리와 꽃밥의 형태를 평가하여 정의됩니다. 수분되지 않은 꽃을 포함하는 스파이크는 컴팩트 한 (분지가없는) 암술머리와 녹색 꽃밥을 특징으로하는 반면, 수분 된 스파이크는 확장 된 스파이클릿, 확장되고 넓게 분기 된 암술머리, 부풀어 오른 난자, 열린 꽃밥 및 무료 꽃가루를 포함했습니다. DOP의 꽃은 중간 표현형을 나타냅니다. 꽃밥은 노란색을 띠고 쉽게 파괴된 다음 꽃가루를 방출했습니다. 암술머리는 암술의 시그마 가지들이 널리 퍼져 있었다(그림 1C).

보리 종자 발달은 부분적으로 중복되는 세 가지 단계를 포함합니다 1,10. 단계 I (수분 후 0 – 6 일; DAP)는 세포 증식과 전분 합성의 부재로 대표되는 이중 수정에 의해 시작됩니다. II 단계 (7 – 20 DAP)는 전분 및 단백질 저장 분자의 생산과 함께 분화 및 큰 바이오 매스 획득으로 구성됩니다. III단계(21 DAP 이후)는 종자 성숙, 건조에 의한 체중 감소 및 휴면 시작에 해당합니다. 또는 단계를 각각 early, middle 및 late라고 합니다11.

보리 곡물은 lemma, palea, glumes12로 구성된 껍질로 덮여 있습니다. 대부분의 보리 유전자형에서 껍질은 마른 씨앗을 단단히 감쌉니다. 종자 자체는 배아(embryo), 배유(endosperm) 및 종자 모계 조직(seed maternal torg)에 의해 형성됩니다(그림 1A). 이배체 배아는 하나의 정자 세포 핵에 의한 난자 세포의 수정에서 비롯됩니다. 완전히 발달 된 종자에서 배아는 라디클을 둘러싼 coleorhiza가있는 배아 축, 싹 분열 분열 및 1 차 잎을 둘러싸는 coleoptile, 그리고 scutellum (자엽) 1 , 10 , 13 , 14 로 구성됩니다. 삼배체 배유(triploid endosperm)는 두 번째 정자 세포 핵에 의한 이배체 중심 세포의 수정의 결과입니다. 배유의 증식은 세포융합(coenocyte) 단계에서 시작되며, 여기서 분열하는 핵은 중앙 액포에 의해 주변부로 밀려납니다. 세포융합기가 끝나면 미세소관이 핵 주위에 방사형 네트워크를 형성하고 반클리널 세포벽 형성과 배유 세포화의 시작을 나타냅니다. 배유 분화는 세포화와 동시에 발생하며 5개의 주요 조직, 즉 녹말 배유, 전달 세포, 알레론층(aleurone) 및 아알루론층(subaleurone layer), 배아 주변 영역(embryo around region)을 생성합니다. 종자 모계 조직(seed maternal torg)은 과피(pericarp)와 종피(seed coats)를 포함하는 모계 기원의 다층 이배체 구조이다10,12. 종자 모계 조직(seed maternal tissue containing containing a nucellar projection on the dorsal side of the grainal side of transport related function)은 수송 관련 기능을 가지고 있으며, 종자 발달의 후반 단계에서 배유(endosperm)에 내장된다15.

figure-introduction-1
그림 1: 보리 종자 개발. (A) 종자 모계 조직(SMT, 녹색), 배유(END, 노란색), 배아(EMB, 주황색) 및 선체(H, 회색)가 표시된 시상 계획에서 곡물 곡물의 개략도. (B) 개화점에 가까운 보리 스파이크의 형태. 비늘 막대 = 1cm. (C) 수분 전, 수분 중 및 수분 후 단계에서 암술머리와 꽃밥의 형태. 삽입은 꽃가루 알갱이(화살촉)가 있는 암술머리의 세부 사항을 보여줍니다. 스케일 바 = 5mm, 삽입 바 = 200μm. (D) 4, 8, 16 및 24 DAP 시드의 시상 및 횡단면. (NP, 핵 돌기) 스케일 바 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최근 고처리량 유전체학(high-throughput genomics)의 발전은 개별 종자 조직 발달 연구를 위한 도구를 제공합니다. 그러나, 이러한 목적의 주요 장애물은 종자 조직1의 조밀 한 구조와 단단한 접착력입니다. 우리는 가능성이 있는 보리 종자를 개발하는 것부터 RNA 염기서열 분석과 같은 매우 민감한 분석에 차후에 사용할 수 있도록 종자 조직의 고순도 해부를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 제시된 프로토콜은 다른 곡물에 쉽게 적용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 식물 성장

참고 : 단일 보리 식물에는 일반적으로 5-6 개의 경운기가 있고 각 스파이크의 중간 5-6 개의 이삭 만 해부에 사용해야한다는 점을 고려할 때 식물 당 최대 수확량은 2 열 품종의 경우 72 개의 종자, 6 열 품종의 경우 216 개의 종자입니다.

  1. 보리 씨앗을 발아시키려면 한 겹의 여과지로 덮인 세 겹의 셀룰로오스 티슈 페이퍼로 채워진 페트리 접시를 준비합니다. 증류수로 수분을 공급하여 과도한 물이 없도록 하고 표면에 씨를 놓고 페트리 접시를 닫습니다. 여과지는 셀룰로오스 조직을 통해 뿌리가 자라는 것을 방지합니다. 어둠 속에서 25 ° C에서 3 일 동안 씨앗을 발아시킵니다.
    알림: 또는 젖은 토양 혼합물에 직접 넣어 씨앗을 발아시킵니다(1.2단계 참조).
  2. 눈에 보이는 라디클과 약 5cm의 싹을 가진 발아 종자를 흙과 모래가 혼합 된 5cm x 5cm 이탄 화분으로 옮깁니다 (3 : 1, v / v). 정기적으로 물을 주십시오. 10일 후, 같은 토양 혼합물로 채워진 12cm x 12cm 화분에 식물을 옮깁니다.
  3. 통제 된 장일 체제 (16 시간 낮 20 ° C, 8 시간 밤 16 ° C, 광도 200 μmol m-2 s-1, 습도 60 %)의 기후 챔버에서 식물을 재배합니다.
    참고: 봄 보리는 파종부터 개화기 시작까지 약 8-10주가 소요되며 vernalization이 필요하지 않습니다. 겨울 보리는 개화를 유도하기 위해 7-8 주간의 vernalization (짧은 낮 조건, 8 시간 낮 4 ° C, 16 시간 밤 4 ° C, 광도 200 μmol m-2 s-1, 습도 85 %)이 필요합니다.

2. 수분의 결정

참고: 발달 진행의 적절한 추정을 위해서는 수분에 대한 정확한 결정이 필요합니다. 보리는 자가 수분을 하는 종입니다. 수분일(DOP)을 정의하기 위해 자가수분일을 모니터링했습니다. 이 특성은 품종에 따라 다르지만 잎 칼집에서 차양이 돌출되기 시작하는 것은 DOP에 접근하고 있음을 나타내는 좋은 지표입니다(그림 1B).

  1. 스파이크를 덮고 있는 잎 덮개를 엽니다. 뾰족한 핀셋을 사용하여 스파이크 중앙 부분에 있는 이삭 내부의 꽃밥과 난소를 확인합니다. 노란색 꽃밥과 "푹신한" 암술머리가 있는 이삭은 몇 시간 이내에 수분되며16 DOP로 간주됩니다(그림 1B).
  2. 마지막 이삭의 끝 부분에 있는 스파이크를 잘라내고 깃대 잎과 차양 윗부분을 제거합니다. 그런 다음 각 이삭에서 선체의 상단 1/3을 잘라냅니다. 이것은 꽃밥을 건조시키고 꽃가루의 더 동기화된 개방과 방출로 이어집니다.
  3. 스파이크 ID, 식물 번호 및 정의된 DOP 날짜가 표시된 글라신지 백으로 스파이크를 덮습니다. 이것은 또한 특정 실험을 손상시킬 수 있는 교차 수분을 방지합니다.
  4. 표 형식 편집기에 정보를 기록해 둡니다. 다음 공식을 사용하여 조직 분리가 이루어져야 하는 수분(DAP) 후 날을 계산합니다.
    xDAP = DOP + x
    x = 예상 DAP
    참고: 값은 '데이터' 형식이어야 합니다.
  5. 종자 조직 해부의 경우 준비된 표 달력에 따라 DAP에서 스파이크를 수집합니다.

3. 종자 조직의 해부

알림: 다음 단계는 실체 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 핀셋을 사용하여 해부하기 전에 선체를 제거하십시오. 선체는 약 16 DAP에서 더 건조하고 접착력이 높아집니다. 생리적 조건을 유지하고 해부 중 식물 물질의 건조를 피하려면 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH = 7.4) 한 방울에 샘플을 넣어 촉촉하게 만듭니다. 각 조직을 해부하기 위해 새로운 seed를 사용하여 샘플 수집 시간 연장으로 인한 DNA, RNA 또는 단백질 분해를 방지합니다. 해부된 물질에서 RNA를 분리하려면 RNase가 없는 물질과 화학 물질만 사용하십시오. RNA 분해를 최소화하기 위해 일반적으로 5-10개의 종자에서 절개된 조직으로 구성된 하나의 샘플에 대해 총 해부 시간인 15분을 초과하지 마십시오.

  1. 조직을 해부하기 전에 뾰족한 핀셋을 사용하여 나머지 껍질을 제거합니다. 1×PBS로 1분 동안 보습하면 이삭의 건조한 잔여물을 제거하는 데 도움이 됩니다.
  2. 껍질을 벗긴 씨앗을 1×PBS 한 방울과 함께 페트리 접시에 놓고 뾰족한 핀셋, 가는 바늘 및 미세 모세관 피펫을 사용하여 개별 부품을 해부합니다. 개별 조직의 해부에는 약간 다른 전략이 적용됩니다: 종자 모계 조직(3.3단계), 배아(3.4단계) 및 배유(3.5단계).
  3. 종자 모계 조직의 해부
    1. 최대 8 DAP의 씨앗 해부
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 세로축을 따라 씨앗을 부드럽게 자르고, 핀셋을 사용하여 정점에서 기저 부분까지 배유와 접하는 마지막 층을 제외한 씨앗 모계 조직을 벗겨냅니다.
      2. 5 - 10 종자의 종자 모계 조직을 50 μL의 1× PBS가 있는 1.5 mL 튜브에 모으고, 피펫을 사용하여 완충액을 버리고, 100 μL의 PBS로 조직을 두 번 헹구고, 피펫팅으로 과도한 완충액을 제거하고 튜브를 닫고 액체 질소에서 동결하거나 유세포 분석 ploidy 측정에 직접 사용합니다. 물질의 양은 일반적으로 하나의 다운스트림 애플리케이션(예: RNA 분리 또는 유세포 분석 ploidy 측정)에 충분합니다.
    2. 8 DAP 후 씨앗 해부
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 씨앗 모계 조직의 복부 쪽 중앙을 부드럽게 자르고 핵 돌기를 포함한 전체 씨앗 주변의 조직을 점차적으로 벗겨냅니다. 각 다운스트림 응용 프로그램에 대해 3.3.1 단계에서 설명한 대로 5-10개의 씨앗에서 조직을 수집하고 세척합니다.
  4. 배아 해부
    1. 8 DAP 이하의 종자 해부
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 씨앗의 1/3을 자릅니다. 분리된 부분을 조심스럽게 반으로 나누고 배아를 방출합니다. 각 다운스트림 응용 프로그램에 대해 3.3.1에 설명된 대로 10-20개의 종자를 수집하고 세척합니다.
    2. 8 DAP 후 씨앗 해부
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 복부 쪽의 기저 부분에서 씨앗 모계 조직을 제거합니다. 배아 둘레의 얇은 배유층을 미세한 바늘이나 뾰족한 핀셋으로 부드럽게 교란하고 배아를 벗겨냅니다. 각 다운스트림 응용 프로그램에 대해 3.3.1에 설명된 대로 최대 5개의 종자에서 배아를 수집하고 세척합니다.
  5. 배유 해부
    1. 4개의 DAP 종자에서 세포융합 배유 해부.
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 배유와 접하는 세포의 마지막 층을 제외한 씨앗 모계 조직을 제거합니다. 얇은 바늘로 복부 쪽 중앙의 층을 부드럽게 뚫고 미세 모세관 피펫을 사용하여 모세관 작용으로 세포융합 배유를 빨아냅니다.
      2. 각 다운스트림 응용 분야에 대해 10 - 15개의 seed에서 액체 배젖을 계획된 다운스트림 분석에 적합한 완충액(즉, 1x PBS, RNA 분리 완충액, 유세포 분석 완충액)이 있는 새로운 1.5mL 튜브로 수집합니다. 버퍼 부피는 계획된 다운스트림 적용에 대한 프로토콜을 반영해야 합니다. 액체 질소에서 얼립니다.
    2. 5에서 8 DAP 종자에서 celullarizing 배유 해부
      1. 등쪽에 씨앗을 놓고 모든 씨앗 모계 조직과 배아를 제거합니다. 각 다운스트림 응용 분야에 대해 10-15개의 종자를 수집하여 1x PBS가 있는 새로운 1.5mL 튜브에 넣고 액체 질소로 동결합니다.
    3. 8 DAP 후 종자에서 celullarized 배유 해부
      1. 등 쪽에 씨앗을 놓고 모든 씨앗 모계 조직과 배아를 제거합니다. 각 다운스트림 응용 프로그램의 경우 3.3.1단계에 설명된 대로 튜브당 단일 종자에서 배유를 수집하고 세척합니다.
  6. 분리된 재료가 있는 튜브를 사용할 때까지 – 80°C에서 보관하십시오.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 유세포 분석을 이용한 조직 순도 조절

참고: RNA 분리 전에 유세포 분석을 사용하여 샘플 순도를 확인할 수 있습니다. 적절한 기기 교정은 생물학적 시료 분석에 매우 중요합니다. 유세포 분석기/ploidy 분석기 광학 장치는 일반적으로 변동 계수(CV) < 2%에 도달하는 최대 피크 선명도까지 보정 비드(형광 염색 폴리스티렌 미세구, 크기 및 형광 강도와 관련하여 매우 균일함)를 사용하여 조정해야 합니다. 곡물 종자 조직은 주로 G1, G2 및 내복제 핵의 집단을 포함합니다. 따라서 로그 척도를 사용하는 것이 좋습니다. 대부분 G1 핵을 포함하고 기저 ploidy control 역할을 하는 잎 조직으로 시작합니다.

  1. 갓 준비한 샘플을 사용하십시오.amp얼음(3.3.1단계 참조) 또는 냉동 조직에 보관된le 17.
    참고: 전체 < 8 DAP 샘플이 유세포 분석에 사용되기 때문에 이는 간접 대조군만을 나타냅니다. 연구자들은 < 8개의 DAP 샘플로 RNA 분리를 진행하기 전에 순수 샘플의 높은 비율(>90%)에 도달할 때까지 여러 번의 분리 및 측정을 수행하는 것이 좋습니다.
  2. 300 μL의 Otto I 완충액 (0.1 M 구연산 일수화물, 0.5 % (v / v) Tween 20, 0.22 μm 필터를 통해 여과 됨) 18을 포함하는 1.5 mL 튜브에서 플라스틱 절구공이를 5-10 회 회전시켜 조직을 균질화하여 4 및 8 DAP 배아 샘플에서 핵을 방출합니다 (다른 샘플의 경우 4.4 단계 참조).
  3. 50μm 나일론 메쉬를 통해 조잡한 현탁액을 유세포 분석 튜브에 여과하고 2μg mL-1 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)18을 포함하는 600μL의 Otto II 완충액(0.4M, Na,2, HPO,4·12H, 2O)을 추가하여 DNA를 염색합니다.
  4. 다른 모든 조직(16 DAP 이상 배아 포함)을 500μL의 Otto I 완충액이 포함된 페트리 접시에 놓고 면도날로 다져 균질화합니다. 단계 4.3에서와 같이 현탁액을 여과하고 DAPI가 함유된 Otto II 완충액 1mL로 염색합니다.
    알림: 날카로운 양날 면도날을 사용한 조작은 특별한 주의가 필요합니다. 부상 위험을 줄이기 위해 단일 가장자리 면도날 또는 특수 면도날 홀더를 사용할 수 있습니다.
  5. 유세포 분석기를 사용하여 샘플의 핵 DNA 함량을 추정합니다. 시료 순도를 분석하기 위해 시료당 최소 2000개의 입자가 필요합니다.

5. RNA 분리 및 품질 측정

  1. 내인성 리보뉴클레아제에 의한 RNA 분해를 방지하기 위해 냉동 조직을 사용합니다. 종자 모계 조직 및 배아 샘플에서 시판되는 키트 또는 TRIzol 시약을 사용하여 RNA를 분리합니다19. 배유 조직의 전분 함량이 높기 때문에 문제가 있는 조직에 대한 상용 온-컬럼 RNA 추출 프로토콜(예: Spectrum Plant Total RNA Kit)을 사용하여 온-컬럼 DNase I 처리로 모든 샘플에서 total RNA를 분리합니다20.
  2. RNA 겔 전기영동 전용 프로토콜 또는 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA 농도 및 무결성을 측정합니다.
    참고: 온전한 총 RNA는 각각 약 1.9 및 3.7 kb 크기의 명확한 18S 및 25S rRNA 띠/피크를 가지고 있습니다. 25S rRNA 밴드는 18S rRNA 밴드보다 약 2배 더 강해야 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

보리 종자 발달에 대한 조직 특이적 전사체 분석을 수행하기 위해 고순도 조직 분리를 위한 프로토콜을 수립했습니다. 이 프로토콜은 껍질을 벗긴(수동으로 껍질을 제거한 후) 곡물에서 배아, 배유 및 종자 모계 조직을 수동으로 해부하는 것을 기반으로 합니다(그림 1A). 이 프로토콜은 여러 2열 및 6열 봄 보리 품종에서 물질을 분리하는 데 성공적으로 사용되었으며, 스파이크는 주어진 DAP에서 수확하여 고정 없이 추출에 직접 사용되었습니다(그림 1D).

DOP의 정의는 해부 전에 추정해야 하는 중요한 매개변수였습니다. 보리 스파이크는 중간에서 가장자리로 성숙합니다. 따라서 DOP 평가에는 중간 꽃이 사용되었습니다. 기껏해야 스파이크 중앙에서 나온 6개의 씨앗이 조직 해부에 사용되었습니다. 자가수분 성공률은 100%에 가까웠다. 이에 비해 수동 수분은 성공률이 훨씬 낮았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에서는 보리 종자 조직의 고순도 분리를 허용하는 프로토콜을 제시합니다. 보리를 위해 개발되고 테스트되었지만, 밀, 귀리, 호밀 또는 삼백초와 같은 Triticeae 부족의 다른 구성원에게 쉽게 채택 될 수 있습니다27. 종자 조직 해부에 초점을 맞춘 프로토콜의 초기 부분은 비표준 또는 값비싼 장비를 필요로 하지 않으므로 많은 과학자들이 접근할 수 있어야 합니다. 철저한 품질 관리 분석을 위해서는 유세포 분석기와 같은 고도로 전문화된 기기가 필요합니다. 그러나 많은 식물 연구 기관에는 숙련된 연구원이 운영하는 유세포 분석기 또는 ploidy 분석기가 있습니다.

식물 수분을 위해 우리는 보리의 자가 수분 능력을 활용하고 정확한 자연 수분일을 정의하는 일련의 간단한 형태학적 매개변수에 의존합니다. 따라서 이 프로토콜은 많은 식물 종에 적용되는 일반적인 접근 방식인...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

유세포 분석기 유지 보수에 대해 Jan Vrána 박사와 Mahmoud Said 박사, 완충액 준비에 대해 Eva Jahnová, 재료 목록에 대해 Marie Seifertová, 식물 관리에 대해 Zdenka Bursová에게 감사드립니다. 이 연구는 주로 체코 과학 재단 보조금 18-12197S의 지원을 받았습니다. A.P.는 체코 과학 아카데미(Czech Academy of Sciences)의 J. E. Purkyně 펠로우십(J. E. Purkyně Fellowship)과 ERDF 프로젝트 "지속 가능한 글로벌 개발을 위한 도구로서의 식물"(No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 um 필터MerckSLGSV255F
1.5 ml Eppendorf tubeSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phenylindoleInvitrogenD21490
50 um 나일론 메쉬실크 a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
전구 어셈블리Drummond Scientific Company1-000-9000
캘리브레이션 비드InvitrogenA16502
셀룰로오스 티슈 페이퍼
구연산 일수화물Penta13830-31000
기후 챔버Weiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
필터 paperFagron
Fine-pointed 핀셋Fine Science Tools11254-20
유세포 분석기Sysmex-Partec
유세포 분석 튜브Sarstedt55.484
Freezer
Glassine bag
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
액체 질소Linde
미세 모세관 피펫Fivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien 핀정밀 과학 도구26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
이탄 냄비Jiffy5x5 cm
페트리 접시
핀 홀더Fine Science Tools26016-12
플라스틱 유봉p-LabA199001
냄비12x12 cm
면도날질레트
RNAse zapInvitrogenAM9780
모래
가위미세 과학 도구14060-11
토양
스펙트럼 식물 총 RNA 키트시그마 AldrichSTRN50
실체 현미경Olympus
Tween 20Sigma AldrichP2287
TRIzol 시약Invitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513

참고문헌

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

isolationisolationisolationRNA
동영상 곧 제공

관련 논문