금 나노 입자와 Cucurbit[n]uril의 응집체 내에서 정확한 플라즈몬 나노 접합의 형성을 통한 요산의 정량적 SERS 검출

퓨린 뉴클레오티드의 신진 대사의 최종 산물 인 요산은 통풍, 자간전증, 신장 질환, 고혈압, 심혈관 질환 및 당뇨병 1,2,3,4,5와 같은 질병의 진단을위한 혈액 혈청 및 소변의 중요한 바이오 마커입니다. 요산 검출을위한 현재의 방법에는 비색 효소 분석, 고성능 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기 영동이 포함되며, 이는 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 정교한 샘플 준비 6,7,8,9가 필요합니다.

표면 강화 라만 분광법은 진동 지문을 통해 생체 분자를 선택적으로 검출 할 수 있고 고감도, 신속한 반응, 사용 편의성 및 시료 준비 없음 또는 최소와 같은 수많은 이점을 제공하므로 일상적인 진료 시점 진단을위한 유망한 기술입니다. 귀금속 나노입자(예를 들어, Au NPs)에 기초한 SERS 기판은 표면 플라즈몬 공명(11)에 의해 야기된 강한 전자기 향상을 통해 분석물 분자의 라만 신호를 크기¹⁰의 4 내지¹⁰ 차수만큼 향상시킬 수 있다. 맞춤형 크기의 Au NP는 복잡한 금속 나노복합체(12)의 제조에 시간이 많이 걸리는 것과는 달리 쉽게 합성될 수 있으며, 따라서 이들의 우수한 특성(^13,14,15,16)으로 인해 생물 의학 응용에 널리 사용된다. Au NPs의 표면 상에 거대고리 분자인 cucurbit[n]urils(CBn, 여기서 n=5-8, 10)의 부착은 고도로 대칭적이고 단단한 CB 분자가 Au NP 사이의 정확한 간격을 제어하고 숙주-게스트 복합체의 형성을 통해 플라즈몬 핫스팟에 중심 또는 근접하게 분석물 분자를 국부화할 수 있기 때문에 분석물 분자의 SERS 신호를 더욱 강화할 수 있다(도 1)^{17, 18,19,20.} Au NP를 사용한 SERS 연구의 이전 예: CBn 나노응집체에는 니트로폭발물, 다환식 방향족제, 디아미노스틸벤, 신경전달물질 및 크레아티닌 21,22,23,24,25 가 포함되며^, SERS 측정은 큐벳에서 수행되거나 맞춤형 샘플 홀더에 작은 물방울을 적재하여 수행됩니다. 이러한 검출 스킴은 높은 재현성을 갖는 복잡한 매트릭스에서 바이오마커를 신속하게 정량화하는데 특히 유용하다.

본원에서, CB7 및 중요한 바이오마커 UA의 숙주-게스트 복합체를 형성하고, 수성 매질에서 Au NPs의 CB7 매개된 응집을 통해 0.2 μM의 검출 한계로 UA를 정량화하는 용이한 방법이 모듈형 분광계를 사용하여 입증되었으며, 이는 진단 및 임상 적용에 유망하다.

1. Au NPs의 합성

1. 종래의 투르케비치 방법을 통한 Au 종자의 합성²⁶
   1. 98.5 mg의 HAuCl4_{· 3H2O}전구체와 유리 바이알에 탈이온수 10 mL.
      참고: 소량의 HAuCl4 전구체를 계량 보트로 옮기고 HAuCl4 전구체가 금속 실험실을 부식시키기 때문에 금속 주걱 대신 플라스틱 주걱을 사용하여 결정을 계량합니다. HAuCl4는 흡습성이므로 가능한 한 신속하게 칭량 단계를 수행해야하므로 대기에서 물을 흡수하여 시간이 지남에 따라 무게가 증가합니다. HAuCl4는 부식성이 강하고 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것을 취급 할 때 특별한주의를 기울이십시오.
   2. 구연산나트륨 분말 64.5 mg을 유리 바이알에 탈이온수 0.5 mL와 함께 용해시켜 500 mM 시트르산나트륨 용액 0.5 mL를 제조하였다.
   3. 25 mM HAuCl4 용액 1 mL를 250 mL 청색 캡핑된 병에 99 mL의 물로 희석하여 0.25 mM HAuCl4 용액 100 mL를 수득하였다.
   4. 0.25 mM HAuCl4 용액 99.5 mL를 콘덴서가 장착된 250 mL 삼구 둥근 바닥 플라스크에 첨가한다. 용액을 격렬한 교반 하에 90°C로 가열하고 15분 동안 온도를 유지한다.
   5. 500 mM 시트르산 나트륨 용액 0.5 mL를 반응 혼합물에 주입하고 온도를 유지하고 용액의 색이 루비 레드로 변할 때까지 교반한다.
      참고 : 반응은 약 30 분이 걸립니다.
2. 운동학적으로 조절된 방법¹³을 통한 Au NPs의 시딩된 성장
   1. 합성된 Au 시드 용액을 70°C로 냉각시킨다.
   2. 10 mL의 시트르산나트륨 분말 154.8 mg을 유리 바이알에 탈이온수 10 mL와 함께 용해시켜 60 mM 시트르산나트륨 용액을 준비한다.
   3. 0.67 mL의 25 mM HAuCl4 용액 및 0.67 mL의 60 mM 시트르산나트륨 용액을 2분의 시간 간격으로 Au 종자에 주입한다.
   4. 단계 1.2.3을 반복하여 Au NP의 크기를 점진적으로 40nm로 증가시킨다.
      참고 : 40nm에 도달하려면 약 10 개의 성장 단계가 필요합니다. 필요한 실제 단계 수는 정확한 설정에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 자동 합성기를 사용한 Au NP의 시드 성장(그림 2)
   1. 섹션 1에서 제조된 Au 시드 용액 25 mL를 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 열믹서에서 70°C로 냉각시킨다.
      참고: 물 25mL가 들어있는 50mL 원심분리 튜브에 넣은 열전대 온도계를 사용하여 열전대 온도계를 사용하여 열믹서 내부의 온도를 모니터링하십시오.
   2. 3 mL 루어락 일회용 주사기를 2.5 mL의 25 mM HAuCl4 용액으로 채운다. 또 다른 3 mL 루어락 일회용 주사기를 2.5 mL의 60 mM 소듐 시트레이트 용액으로 채운다.
   3. 주사기를 시린지 펌프에 넣고 Luer-to-MicroTight 어댑터를 사용하여 PEEK 튜브(150μm 내부 직경)를 주사기에 연결합니다. 튜빙을 열믹서 내의 Au 시드 용액을 포함하는 원심분리 튜브에 삽입한다.
   4. 두 시린지 펌프를 모두 설정하여 0.1675mL의 용액을 20분에 걸쳐 분배합니다(분당 8.357μL).
   5. 써모믹서 회전 속도를 700rpm으로 설정하고 25mM HAuCl4 용액이 포함된 시린지 펌프에서 시작_을 누릅니다.
   6. 2분 후, 60 mM 시트르산나트륨 용액을 함유하는 시린지 펌프 상에서 시작 을 누른다.
   7. HAuCl4 용액 주입을 시작한 지 30분 후, 분석을 위해 Au NP 용액의 분취량을 제거하였다.
   8. 1.3.5 – 1.3.7단계를 반복하여 Au NP의 직경을 최대 40nm까지 점진적으로 늘립니다.
      참고: 이 설정은 1.3.4단계에서 추가된 반응물의 부피를 증가시켜 한 단계에서 Au NP를 최대 40nm까지 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 동일한 주사 속도를 유지하면서 분배 시간을 증가시킴으로써 달성됩니다.

2. Au NP의 특성화

1. UV-Vis 분광법
   1. Au NP 용액 1 mL를 세미 마이크로 석영 큐벳에 첨가한다.
   2. 분광계를 켭니다.
   3. 파장 범위를 400 - 800 nm로 설정합니다.
   4. 각 샘플에 대한 UV-Vis 스펙트럼을 획득한다.
2. 동적 광산란(DLS)
   1. 샘플 용액을 0.22 μm 필터가 있는 플라스틱 세미 마이크로 큐벳으로 필터링합니다.
   2. DLS 계측기를 켭니다.
   3. 온도를 25°C로 설정하고 60초 동안 평형을 이룹니다.
   4. 각 샘플의 유체역학적 크기를 측정합니다.
3. 투과 전자 현미경 (TEM)
   1. 샘플 용액의 5 μL 액적을 C-코팅된 300-메쉬 Cu 그리드 상에 드롭-캐스팅하고 공기 중에서 건조시킨다.
      참고: 희석은 TEM 그리드 상에 잘 분산된 Au NP를 얻기 위해 더 농축된 Au NP 용액 샘플을 위해 필요하다.
   2. 200kV 가속 전압에서 TEM을 사용하여 각 샘플에 대해 여러 TEM 이미지를 획득합니다.
   3. ImageJ를 사용하여 각 샘플에 대한 200Au NP의 직경을 측정하여 평균 크기 및 표준 편차를 계산합니다.

3. CB7-UA 복합체의 형성

1. 0.4 mM CB7 용액의 제조
   1. 4.65 mg의 CB7을 15 mL 유리 바이알에 첨가하십시오.
      참고 : CB7의 양은 문헌의 대부분의 보고서에 의해 사용 된 CB7 (= 1163 Da)의 공식 중량을 기준으로 계산됩니다. 그럼에도 불구하고 CB7 고체 샘플은 일반적으로 합성 및 정제 단계에서 남아있는 물, HCl, 메탄올 및 기타 염을 함유하여 샘플에서 ~ 10 - 20 %의 죽은 중량에 기여합니다. 포획된 용매 및 염은 진공 오븐 또는 다른 수단에서 가열함으로써 제거될 수 없었다. 그들의 양은 샘플의 다른 배치에 따라 다르지만 원소 분석을 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 그러나, 제시된 프로토콜은 CB7 샘플 내의 용매 및 염의 정량화되지 않은 양의 존재에 민감하지 않다.
   2. 바이알에 물 10mL를 넣고 뚜껑을 조이십시오.
   3. CB7 고체가 완전히 용해 될 때까지 실온에서 샘플을 초음파 처리하십시오.
      참고: CB7은 문헌²⁷ 에 따라 합성되었지만 상업적으로 입수가능하다.
2. 0.4 mM UA 용액의 제조
   1. 2.69 mg의 UA를 50 mL 원심분리 튜브에 첨가한다.
   2. 튜브에 물 40mL를 넣고 뚜껑을 조이십시오.
   3. 열믹서를 사용하여 온도를 70°C, 속도를 800rpm, 시간을 2h로 설정하여 시료 용액을 소용돌이친다. 용액을 실온으로 식히십시오.
      참고: UA는 물에 대한 용해도가 낮음(0.40 mM)⁵. UA 분말이 완전히 용해되지 않은 경우 더 오래 소용돌이치십시오. 대안적으로, 초음파는 용해를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
3. 0.4 mM UA 용액의 순차적 희석
   1. 0.4 mM UA 용액 5 mL를 15 mL 유리 바이알에 물 5 mL로 희석하여 0.2 mM UA 용액 10 mL를 수득하였다. 뚜껑을 조이고 30 초 동안 초음파 처리하십시오.
   2. 표 1에 설명된 대로 적절한 양의 UA 및 물을 사용하여 3.3.1단계를 반복합니다.
4. CB7-UA 복합체의 제조
   1. 0.75 mL의 0.4 mM CB7 용액 및 0.75 mL의 0.4 mM UA 용액을 1.5 mL 튜브에 첨가한다. 뚜껑을 고정하고 30 초 동안 초음파 처리하십시오.
   2. 호스트 - 게스트 단지의 형성을 보장하기 위해 30 분 동안 기다리십시오.
   3. 농도가 다른 UA 솔루션을 사용하여 3.4.1 – 3.4.2 단계를 반복합니다.

4. UA의 SERS 감지

1. 라만 시스템의 실험 설정(그림 3)
   1. 633nm He-Ne 레이저(22.5mW)를 켭니다.
   2. 모듈식 라만 분광계를 켭니다.
   3. 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 시작합니다.
   4. 분광기 응용 프로그램 마법사 아이콘을 클릭한 다음 Raman을 선택합니다.
   5. 새로운 인수를 시작하십시오. 통합 시간을 30초로 설정하고, 스캔을 평균으로 5초로, 박스카를 0으로 설정합니다.
   6. 배경 스펙트럼을 저장하고 레이저 파장(즉, 633nm)을 입력합니다.
      참고: 통합 시간은 각 스캔의 시간이며, 평균에 대한 스캔은 각 스펙트럼을 만들기 위해 평균화된 스캔 수이며, boxcar는 평균²⁸개의 인접 픽셀 수입니다.
2. SERS 기판의 형성
   1. 0.9 mL의 40 nm Au NP 용액 및 0.1 mL의 예비-형성된 CB7-UA 복합체 용액을 1.5 mL 튜브에 첨가한다. 뚜껑을 고정하고 용액이 루비 레드에서 보라색으로 바뀔 때까지 초음파 처리하십시오.
      참고: 상업적인 시트레이트-안정화된 40 nm Au NP 용액 샘플이 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 국부적인 표면 플라즈몬 공명 (LSPR) 피크의 광학 밀도는 농축된 원액 샘플로부터의 희석을 통해 1로 조정된다. 샘플 중의 시트레이트 농도는 전형적으로 2 mM로 유지된다.
   2. 샘플 용액을 세미 마이크로 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 라만 샘플 홀더에 넣고 덮개를 닫습니다.
   3. 측정을 시작합니다.
   4. 자동 저장을 설정하여 다섯 개의 연속 SERS 스펙트럼을 기록합니다.
   5. 측정을 중지하고 샘플을 변경합니다.
   6. 다양한 농도의 CB7-UA 용액을 사용하여 4.2.1 – 4.2.5 단계를 반복하십시오.
      참고: 응집 시간은 Au NP의 응집을 매개하는 데 큰 기여를 하는 빈 CB7의 농도의 차이로 인해 0.1 μM UA의 경우 30 초에서 20 μM UA의 경우 30분에 이르는 나노응집체 내의 UA의 농도에 의존하는 것으로 밝혀졌다. CB7-UA 복합체의 경우, 하나의 포털은 부피가 큰 UA 분자에 의해 차단되어, Au NP 표면에 결합하는 것을 사용할 수 없게 되고, 따라서 NP 응집(²¹)을 매개할 수 없게 된다. 샘플은 용액의 색상이 루비 레드에서 보라색으로 변할 때 측정 할 준비가되었습니다.

5. 데이터 분석

1. 데이터 처리
   1. 비대칭 최소 제곱(ALS) 플러그인을 사용하여 베이스라인을 다운로드하여 Origin에 설치합니다.
      참고: ALS 플러그인에는 OriginPro가 필요합니다.
   2. 원시 데이터를 원본에 삽입합니다.
   3. 각 샘플의 다섯 SERS 스펙트럼에서 평균값을 계산합니다. 값을 레이저의 힘(즉, 22.5mW)과 통합 시간(즉, 30초)으로 나눕니다.
   4. ALS 아이콘을 클릭하여 대화 상자를 엽니다. 비대칭 계수를 0.001로, 임계값을 0.03%로, 평활 계수를 2로, 반복 횟수를 20으로 설정하여 각 평균 스펙트럼의 기준선을 수정합니다.
   5. y 오프셋으로 누적된 선을 사용하여 다른 UA 농도의 SERS 스펙트럼을 플로팅합니다. 출력은 라만 시프트 (cm-1)에 대한 강도 (카운트 s-1 ^mW-1)이어야합니다.

제시된 Au NP 합성에서 UV-Vis 스펙트럼은 10 성장 단계 (그림 4 A, B) 후에 LSPR 피크의 521 nm에서 529 nm로 이동을 보여 주며 DLS 데이터는 Au NP의 크기가 25.9 nm에서 42.8 nm로 증가함에 따라 좁은 크기 분포를 보여줍니다 (그림 4C, D). TEM 이미지에서 측정된 G0, G5 및 G10의 평균 크기(그림 4E)는 각각 20.1nm, 2.1nm± 32.5nm, 40.0± 2.2nm±며 각 경우에 200개의 입자가 계수됩니다. 이러한 결과는 이러한 프로토콜이 균일하고 좁게 분산된 Au NP를 합성하는데 효과적임을 나타낸다.

제시된 SERS 연구에서, CB7 및 UA의 숙주-게스트 복합체는 SERS 스펙트럼에서 특징적인 UA 신호에 의해 뒷받침되는 바와 같이, Au NP:CB7 나노응집체 내에서 정확한 플라즈몬 나노접합의 형성을 매개하는 빈 CB7로 형성되었다(도 5A).

CB (+로 표시) 및 UA (*로 표시됨)의 라만 피크에 대한 할당은 표 2에 나와 있습니다. 반대로, CB7의 부재 하에서는 UA의 SERS 신호가 관찰될 수 없으며, Au NP의 응집을 촉발시키는 CB7의 핵심 역할을 예시한다.

20 μM의 일정한 CB7 농도를 재현가능한 플라즈몬 나노구조체 (즉, SERS 기질)의 계내 형성을 보장하도록 UA의 SERS 적정에 사용하였다. 이 프로토콜에 제시된 검출 체계의 높은 감도는 640 cm-1 및 1130 cm-1 (골격 링 변형 및 C-N 진동에 각각 기인 함)에서 UA 피크에서 검출 한계로 알려진 ~ 0.2 μM (그림 5B-D)까지의 명확한 SERS 신호를 관찰함으로써 입증되었습니다. 또한, UA의 SERS 강도와 로그 농도 사이의 매우 강한 상관관계(R2 > 0.98)가 두 피크 모두에 대해 파워법칙에 의해 얻어졌으며, 선형 영역은 0.2 내지 2 μM의 범위에서 발견되었다(도 5E, F). SERS 강도와 로그 농도 사이의 선형 상관 관계는 좁은 범위의 분석물 농도에 대해 근사 될 수 있지만 SERS 신호는 로그 농도가 음의 무한대에 접근 할 때 0에 접근하는 반면 (즉, 분석 물 농도는 0에 접근함) 데이터에서 관찰 된 바와 같이 유의해야합니다. SERS 신호는 그림 5E, F에 표시된 작은 오류 막대에 의해 입증된 것처럼 재현성이 높습니다.

그림 1: 자체 조립된 Au NP:CB7 나노응집체 내의 정밀한 플라즈몬 나노접합의 개략적인 그림. 인셋은 응집이 빈 CB7에 의해 매개되는 반면, UA는 숙주-게스트 복합체화를 통해 Au NP의 표면에서 농축되는 플라즈몬 나노접합의 확대를 보여준다. 이 계획은 규모에 끌리지 않는다는 점에 유의해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: (a) 자동화된 Au NP 합성기의 개략적인 그림 및 (b) 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 라만 시스템의 개략적인 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: Au NP의 대표적인 특성화. (A) Au NPs의 UV-Vis 스펙트럼 및 (B) 성장 단계의 수가 10으로 증가함에 따라 LSPR 피크의 시프팅을 보여주는 줌인 스펙트럼. (c) Au NPs의 유체역학적 크기 및 (D) 성장 단계의 수의 함수로서 입자 크기의 상응하는 플롯. (e) Au NPs의 TEM 이미지, 5 및 10 성장 단계 후의 Au 종자 및 Au NP의 크기를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: Au NP: CB7 나노응집체 내 UA 검출의 대표적인 SERS 결과. (A) CB7의 존재 또는 부재 하에 UA의 SERS 스펙트럼. CB7 및 UA의 라만 피크는 각각 +와 *로 표시됩니다. (B) 0 내지 20 μM의 농도를 갖는 UA의 전체 범위, (C) 600 - 700 cm-1 줌인 및 (D) 1100 - 1180 cm-1 줌인 SERS 스펙트럼. UA의 주요 라만 봉우리는 *로 표시됩니다. 스펙트럼은 명확성을 위해 기준선을 수정하고 오프셋했습니다. (E, F) UA의 농도에 대한 SERS 피크 강도의 상응하는 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: UA 용액의 순차적 희석.

표 2: CB7 및 UA 2,4,29의 라만 피크에 대한 할당.

저자는 공개 할 것이 없습니다.