이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 크기 및 표면 마커 발현에 의한 건강한 인간 기증자로부터 요로 세포외 소포체(uEV)를 분리하고 표현형 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.
방법 논문
유세포 분석을 사용한 Urinary Extracellular Vesicles의 크기 측정 및 표현형 분석
이 논문에서
요약
초록
세포외 소포체(EV)는 소변과 같은 체액에서 모든 세포 유형에 의해 분비되는 지질막의 이질적인 복합체입니다. EV는 엑소좀과 같이 직경이 40-100nm에서 미세 소포의 100-1000nm에 이르기까지 다양한 크기일 수 있습니다. 그들은 또한 많은 질병의 예후 및 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있는 다양한 분자를 포함할 수 있습니다. 이러한 소포를 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 그 중 하나가 유세포 분석입니다. 그러나 바이오마커 검출과 함께 EV의 농도를 정량화하고 크기별로 구별하는 방법을 보여주는 기존 보고서는 없습니다. 이 작업은 구성을 수정하지 않고 분석을 위해 기존 세포분석기를 사용하여 요세포외 소포체(uEV)의 분리, 정량화 및 표현형화 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 방법의 한계는 샘플당 최대 4개의 서로 다른 바이오마커를 염색하는 것입니다. 이 방법은 또한 샘플에서 사용할 수 있는 EV의 양에 의해 제한됩니다. 이러한 한계에도 불구하고 이 프로토콜과 후속 분석을 통해 신장 및 뇌 손상과 관련된 질병에서 EV 마커의 농축과 소변 샘플에 존재하는 이러한 소포의 풍부함에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
서론
포유류에서 혈액은 신장을 250-300 번 통과하여 여과됩니다. 이 기간 동안 소변이 형성됩니다. 이 생체 유체의 생산은 사구체 여과, 세뇨관 재흡수 및 분비를 포함한 일련의 과정의 결과입니다. 대사 노폐물과 전해질은 소변의 주요 구성 요소입니다. 또한 펩타이드, 기능성 단백질 및 세포외 소포체(EV)와 같은 다른 부산물은 1,2,3,4,5,6으로 배설됩니다. 초기에는 수분 균형 장애를 앓고 있는 환자의 소변 샘플에서 요로 세포외 소포체(uEV)가 확인되었습니다. 이 환자들은 아쿠아포린-2(AQP2)와 같은 분자의 존재를 보였으며, 이 분자는 이 질병의 바이오마커로 사용되었습니다7. 몇 가지 후속 연구는 uEV의 세포 기원을 확인하는 데 초점을 맞추었으며, 이러한 구조가 신장 세포(사구체, 포도사이트 등) 및 기타 세포 유형의 내피 또는 백....
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프로토콜
인간의 소변 샘플은 기증자 동의서에 서명한 건강한 지원자로부터 채취했습니다. 이러한 절차는 Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán Research Ethics Committee의 승인도 받았습니다.
1. 소변 세포외 소포체의 분리
참고: uEV의 절연 프로토콜은 ref.19에서 수정되었습니다. 그림 1 은 uEV를 격리하기 위한 프로토콜의 표현을 보여줍니다.
그림 1: 유세포 분석을 위한 uEVs 분리 개요. 이 프로토콜에서는 먼저 하루의 첫 번째 소변을 원심 분리하여 세포와 파편을 제거합니다. 그런 다음 THP 단백질을 제거하는 처리로 큰 소포를 제거하기 위해 원심분리기....
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결과
프로토콜을 통해, 그리고 uEV를 염색하기 전에 여러 체크포인트가 있습니다. 따라서 먼저 uEV 추출물에 존재하는 단백질의 양을 확인하는 것이 중요합니다. 세포외 소포체를 다루는 모든 연구 그룹은 2.1단계에서 설명한 것처럼 단백질을 정량화합니다. 보충 그림 2 는 웰 4E, 5E 및 6E에서 uEV 분획을 포함하는 대표적인 96 웰 플레이트를 보여줍니다. 웰 1A, 2A 및 3A는 블랭크로 구성되지만 정제된 uEV가 없는 경우 웰은 유사한 색상을 취합니다.
이 단계 후에는 uEV의 존재를 확인해야 합니다. 보충 그림 3 은 Coomassie blue로 염색된 폴리아크릴아미드 겔의 대표적인 결과를 보여주며, 수집된 모든 분획에 존재하는 단백질의 양을 보여주고, uEV를 분리하기 위한 다른 방법론과의 비교를 수행합니다. 두 가지 환원제인 디티오트레이톨(DTT)과 β-메르캅토에탄올 중 두 번째 환원제는 단백질 수율이 더 우.......
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토론
요즘에는 여러 질병에 대한 바이오마커로 세포 외 소포체의 사용이 증가했으며, 특히 소변과 같은 비침습적 소스에서 분리할 수 있는 질병의 경우 5,21,22,23,24. uEV의 격리는 건강한 개인의 상태와 여러 질병을 앓고 있는 환자의 진단/예후를 아는 데 중요한 자원임이 입증되었습니다 6,13,16,25,26,27.
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공개 사항
저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 재정적 또는 상업적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 CONACyT(A3-S-36875) 및 UNAM-DGAPA-PAPIIT 프로그램(IN213020 및 IA202318)의 보조금으로 지원되었습니다. NH-I는 CONACyT의 펠로우십 587790의 지원을 받았습니다.
저자는 이 프로토콜의 실현을 위해 귀중한 조언을 해준 Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr 및 Diana Gómez-Martin과 소변 샘플에 대해 모든 건강한 개인에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| APC anti human CD156c (ADAM10) 항체 | BioLegend | 352706 | Add 5 µ L에서 20 µ PBS |
| APC 항 인간 TSPAN33 (BAAM) 항체 | BioLegend | 395406 | 5 µ를 더하는 uEVs의 L; L에서 20 µ |
| JA-25.5O 고정각 로터가 있는 PBS Avanti 원심분리기 | Beckamn Coulter | J-26S XPI | |
| BD Accuri C6 유세포분석기 | BD Biosciences | ||
| β-mercaptoethanol | SIGMA-Aldrich | M3148 | |
| A-4-44 로터가 있는 탁상용 원심분리기 | Eppendorf | 5804 | |
| BLUEstain 2 단백질 사다리 | GOLDBIO | P008 | |
| CD9 (C-4) 마우스 단클론 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | |
| CD63 (MX-49.129.5) 마우스 단클론 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| Cell Trace CFSE cell proliferation kit for flow cytometry Thermo | Scientific | C34554 | |
| Chemidoc XRS+ system | BIORAD | 5837 | |
| FITC anti 인간 CD9 항체 | BioLegend | 312104 | Add 5 µ L에서 20 µ PBS |
| FITC 항 인간 CD37 항체 | BioLegend | 356304 | 5 µ를 추가하는 uEVs의 L; L에서 20 µ PBS 형광 노란색 입자의 uEV의 L |
| Spherotech | FP-0252-2 | ||
| 형광 노란색 입자 | Spherotech | FP-0552-2 | |
| 형광 노란색 입자 | Spherotech | FP-1552-2 | |
| FlowJo Software | Becton, Dickinson and Company | ||
| Goat anti-mouse immunoglobulins/HRP | Dako | P0447 | |
| Halt 프로테아제 억제제 칵테일 | Thermo Scientific | 78429 | |
| Immun-Blot PVDF 멤브레인 0.22µ m | BIORAD | 1620177 | |
| Megamix-Plus FSC 비즈 | COSMO BIO CO. LTD | 7802 | |
| NuPAGE LDS 시료 버퍼 4X | Thermo Scientific | NP0007 | |
| Optima 초원심분리기(로터 90Ti 고정각 포함) 355530 | Beckamn Coulter | XPN100 | |
| Page Blue 단백질 염색 용액 | Thermo Scientific | 24620 | |
| PE anti human CD53 항체 | BioLegend | 325406 | Add 5 µ L에서 20 µ PBS |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific | 23227 | |
| Pierce RIPA 버퍼 | Thermo Scientific | 89900 | |
| 폴리카보네이트 두꺼운 벽 원심분리기 튜브 | Beckamn Coulter | 355630 | |
| Spherotech 8-Peak validation beads (FL1-FL3) | BD Accuri | 653144 | |
| Spherotech 6-Peak validation beads (FL4) | BD 아쿠리 | 653145 | |
| 자당 | SIGMA-Aldrich | 59378 | |
| 트리에탄올 아민 | SIGMA-Aldrich | 90279 |
참고문헌
- Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
- Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11
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