이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
급성 설치류 뇌 슬라이스는 전기 생리학, 현미경 검사법 및 약리학을 사용하여 단일 세포 해상도로 신경 회로의 조직과 기능에 대한 통찰력을 얻기 위한 견통 가능한 실험 적 접근법을 제공합니다. 그러나, 시험관 내 실험의 설계에 대한 주요 고려 사항은 생체 내에서 관찰되는 바와 같이 다른 슬라이스 제제가 신경 활동의 자연주의 적 패턴을 재구성하는 정도이다. 그대로 뇌에서, 해마 네트워크는 침엽수 상태 또는 비 REM 수면 중에 발생하는 날카로운 파도 잔물결 복합체(SWRs)에 의해 예시된 바와 같이 동물의 행동 상태를 반영하는 고도로 동기화된 인구 활성을 생성한다. SWRs 및 기타 형태의 네트워크 활동은 적절한 조건하에서 격리된 해마 조각에서 자발적으로 나타날 수 있습니다. 강력한 뇌 슬라이스 툴킷을 해마 네트워크 활성 조사에 적용하기 위해서는 해마 네트워크 내의 조직 건강과 기능적 연결의 보존을 최적화하는 접근 방식을 활용할 필요가 있다. 마우스는 감기 자당 기반의 인공 뇌척수액으로 트랜스카디에 퍼집니다. 해마를 포함하는 수평 조각은 시냅스 연결을 유지하기 위해 450 μm의 두께로 절단됩니다. 슬라이스는 인터페이스 스타일 챔버에서 복구되고 기록용 침수 챔버로 전송됩니다. 기록 챔버는 슬라이스의 산소를 개선하기 위해 높은 유량으로 인공 뇌척수액의 이중 표면 슈퍼퓨전을 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 시험관 내 복잡하고 자발적인 네트워크 활동의 조사에 적합한 건강한 조직을 산출한다.
서론
체외에서 살아있는 해마 슬라이스에서 전기 생리학적 측정은 수많은 장점을 가진 강력한 실험 적 접근 방식입니다. 실험자는 현미경, 미세 조작기 및 기록 시스템을 사용하여 조직의 개별 뉴런에서 측정을 직접 시각화하고 수집할 수 있습니다. 조직 조각은 또한 광유전학, 화학유전학, 또는 약리학 실험을 위한 사진 자극 또는 약 전달에 아주 접근합니다.
해마 네트워크는 생체 내에서매우 동기적인 인구 활성을 생성하며, 세포외 지역 필드 전위1,2,3,4,5에서 진동으로 볼 수있다. 뇌 슬라이스 방법은 이러한 신경 네트워크 진동의 기초 세포 및 회로 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 활용되었습니다. 마이어 외(Maier) 등의 기초 작업은 날카로운 파리플 복합체(SWRs)가 복부 해마6,7의슬라이스에서 자발적으로 나타날 수 있음을 ....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (AC-AAAU9451)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표 1에설명된 대로 슬라이스용 자당 절단 용액을 준비한다.
참고: 1L의 자당 용액을 준비한 후, 얼음 트레이에 소량(약 100~200mL)을 동결하십시오. 이 냉동 자당 얼음 큐브는 얼음 슬러리에 혼합됩니다 (4.3 단계 참조). - 표 2에설명된 대로 기록용 인공 뇌척수액(ACSF)을 준비한다.
- 미량 금속 및 기타 불순물을 제거하기 위해 여과된 정제수 1mL에서 NaCl0.05844 g의 NaCl을 용해시켜 자극 파이펫을 위한 NaCl 1M을 준비합니다.
참고: 자당 절단 용액과 ACSF는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다.
2. 한천 경사로 준비
- 미량 금속 및 기타 불순물을 제거하기 위해 여과된 정제수로 한천 분말을 용해시켜 4% 한천(예: 50mL의 물 속 의 한천 2g)을 준비하십시오. 혼합물을 전자레인지에 가열하여 끓이기 시작할 ....
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결과
여기에 이 프로토콜에 설명된 대로 준비된 HEC 슬라이스의 대표 녹음이 있습니다. 인터페이스 유지 챔버(도1C)에서회수한 후, 슬라이스는 침수된 기록 챔버(도2B)로개별적으로 전달된다. 레코딩 챔버는 연동펌프(도 2A)를사용하여 카보겐 포화 ACSF로 공급된다. 펌프는 먼저 ACSF를 홀딩 비커에서 가열된 저수지로 끌어들입니다. 카보겐 라인은 미디어의 지속적인 산소화를 제공하기 위해 보유 비커와 가열 된 저수지 모두에 배치됩니다. 일련의 공기 채워진 주사기로 구성된 맥동 댐퍼는 연동 펌프와 레코딩 챔버 사이에 위치하여 급속한 연동에 의해 생성되는 유속의 변동을 최소화합니다. 각 주사기의 에어 포켓은 펌프의 각 사이클에 의한 압력의 변화를 흡수하여 레코딩 챔버가 ACSF52,53.......
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토론
조직 건강을 촉진하고 자발적인 자연주의 네트워크 활동의 출현을 선호하도록 설계된이 슬라이싱 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있습니다 : 마우스는 차가운 자당 절단 용액으로 전사적으로 퍼집니다. 수평 내측 피질 (HEC) 슬라이스는 중간 또는 복부 해마에서 450 μm의 두께로 절단됩니다. 슬라이스는 따뜻한 ACSF와 가습, 환생이 풍부한 공기의 인터페이스에서 복구; 기록 중 슬라이스는 ACSF를 32°C로 따뜻하게 하고 침수된 레코딩 챔버에서 이중 표면 슈퍼퓨전으로 빠른 유량으로 전달됩니다.
슬라이스 건강은 시험관 내 네트워크 진동의 생성에가장 중요합니다. 젊은 동물은 더 건강한 조각을 산출하고, 일반적으로 청소년 또는 사춘기 마우스와 함께 경각관류 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 동물이 나이가 들어감에 따라 건강한 조각을 만드는 것이 점점 더 어려워지지만, 일부 조사(예: 질병 모델 또는 경도 연구)는 성인 또는 노화 동물의 사용을 필요로 합니다. Dengler 등은.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 스티브 시겔바움의 지원에 감사드립니다. 자금 조달은 5R01NS106983-02뿐만 아니라 1 F31 NS113466-01에 의해 제공됩니다.
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재료
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| Ag-Cl 접지 펠릿 | Warner | 64-1309, (E205) | |
| 한천 | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| 아스코르브산 | Alfa Aesar | 36237 | |
| 비커(250mL) | Kimax | 14000-250 | |
| 비커(400mL) | Kimax | 14000-400 | |
| 바이오사이틴 | Sigma Aldrich | B4261 | |
| 블렌더 | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn 가위, 작은 | becton, 필라멘트가 있는 Dickinson | 14184-09 | |
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| 롤러 클램프 | 세계 정밀 기기 | 14041 | |
| 스케일 | Mettler Toledo | PM2000 | |
| 메스 핸들 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| 슬라이스 하프 | Warner | SHD-26GH/2 | |
| 중탄산나트륨 | Fisher Chemical | S233-500 | |
| 염화나트륨 | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| 인산나트륨 일염기성 무수 | Fisher Chemical | S369-500 | |
| 피루브산나트륨 | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| 주걱 | VWR | 82027-520 | |
| 주걱/숟가락, 대형 | VWR | 470149-442 | |
| 멸균 메스 블레이드 | Feather | 72044-10 | |
| 교반기/핫 플레이트 | 코닝 | 6795-220 | |
| 스톱콕 밸브, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| 스톱콕 밸브, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| 자당 | Acros Organics | AC177142500 | |
| 스위블 클램프 지원 | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| 수술용 가위, 날카롭고 뭉툭한 | 정밀 과학 도구 | 14001-12 | |
| 주사기(1mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| 주사기(Luer-Lok 팁 포함 60mL) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| 세 갈래 클램프 | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| 조직 겸자, 대형 | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| 조직 겸자, 소형 | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| 트랜스퍼 피펫 | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 튜빙 | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| 튜빙 | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| 진공 그리스 | Dow Corning | 14-635-5D | |
| 진동 블레이드 마이크로톰 | Leica | VT 1200S | |
| 패러데이 케이지가 있는 진동 감쇠 테이블 | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| 부피 측정 플라스크 (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| 부피 플라스크 (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| 온수 목욕 | VWR | 1209 |
참고문헌
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
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- Buzsáki, G.....
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