Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

요약

이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.

초록

형광 in situ hybridization(FISH)은 세포 내 특정 RNA 전사체의 존재 및 공간 분포를 식별하는 분자 기술입니다. 기능적으로 식별된 뉴런의 신경화학적 표현형은 일반적으로 면역조직화학(IHC)을 사용하는 여러 항체(표적 단백질)와의 동시 표지와 현장 교잡(표적 RNA)의 최적화를 동시에 필요로 합니다. 특정 뉴런을 특성화하기 위한 "신경화학적 서명"을 달성할 수 있지만 복잡한 요인에는 방법을 결합하기 전에 FISH 및 IHC 표적을 확인해야 할 필요성과 동일한 조직 섹션 내에서 동시에 표적화될 수 있는 제한된 수의 RNA 및 단백질이 포함됩니다.

여기서는 RNAscope FISH와 형광 면역염색을 각각 사용하여 동일한 뇌 절편에서 여러 mRNA와 단백질을 검출하는 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 제제를 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 면역조직화학적으로 확인된 뇌간 핵에서 저농도 mRNA(예: 갈라닌 수용체 1)와 고농도 mRNA(예: 글리신 수송체 2)의 발현 패턴을 설명하기 위해 결합된 방법을 사용합니다.

FISH 분석의 다운스트림 단백질 라벨링에 대한 주요 고려 사항은 조직 준비 및 FISH 프로브 라벨링의 최적화를 넘어섭니다. 예를 들어, 항체 결합 및 표지 특이성은 FISH 프로브 분석 내에서 단백질 분해 효소 단계에 의해 해로운 영향을 받을 수 있음을 발견했습니다. 프로테아제는 펩타이드 결합의 가수분해 절단을 촉진하여 FISH 프로브가 세포에 쉽게 진입할 수 있도록 하지만, 후속 IHC 분석에서 표적이 되는 단백질을 분해하여 표적 결합을 생성할 수도 있습니다. 표적 단백질의 세포 내 위치는 FISH 프로브 분석 후 IHC 성공에 기여하는 또 다른 요소입니다. 표적 단백질이 막 결합되어 있을 때 IHC 특이성이 유지되는 것을 관찰한 반면, IHC 표적 세포질 단백질은 광범위한 문제 해결이 필요했습니다. 마지막으로, 슬라이드 장착형 고정 냉동 조직의 취급이 신선 냉동 조직보다 더 어렵다는 것을 발견했지만, RNAscope와 결합했을 때 IHC 품질은 고정 냉동 조직에서 전반적으로 더 좋았습니다.

서론

신경화학적으로 뉴런의 하위 집단을 정의하는 단백질과 mRNA는 일반적으로 각각 면역조직화학(IHC) 및/또는 제자리 교잡(ISH)의 조합으로 식별됩니다. ISH와 IHC 기법을 결합하면 다중 라벨링 용량을 극대화하여 기능적 뉴런(신경화학적 코딩)에 고유한 공동 국소화 패턴의 특성화를 용이하게 할 수 있습니다.

RNAscope를 포함한 형광 ISH(FISH) 분석법은 방사성 ISH 및 비방사성 발색 ISH와 같은 이전 RNA 검출 방법에 비해 감도와 특이도가 더 높습니다. FISH는 단일 mRNA 전사체를 반점 염색 지점으로 시각화할 수 있습니다¹. 또한 RNAscope 분석을 통해 다양한 형광단 태그를 사용하여 한 번에 더 많은 수의 RNA 표적을 라벨링할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고 기술적 한계는 단일 실험에서 사용할 수 있는 형광단/염색체의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 현미경 필터 세트의 가용성이 포함됩니다. 이러한 고려 사항은 신경화학적 식별이 FISH와 IHC를 결합한 것을 사용할 때 각 기술을 개별적으로 사용하는 것과 비교할 때 복잡해지는데, 이는 한 방법에 최적화된 고유한 단계가 다른 방법에 해로울 수 있기 때문입니다.

IHC와 결합된 FISH의 이전 적용은 인간 B세포 림프종², 병아리 배아³, 제브라피시 배아⁴, 마우스 망막⁵ 및 마우스 내이 세포⁶에서 특정 세포 표적의 발현을 입증했다. 이 연구에서 조직 준비는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)^2,3,5 또는 신선한 전체 마운트 ^4,6이었습니다. 다른 연구에서는 고정 마우스 및 쥐 뇌 제제에 발색 RNAscope를 적용했습니다 ^7,8,9. 특히, Baleriola et al.^{도 8}은 ISH-IHC 병용을 위한 두 가지 상이한 조직 제제를 설명하였다; 고정 마우스 뇌 절편 및 FFPE 인간 뇌 절편. 최근 간행물에서 우리는 신선 냉동 절편에 FISH와 형광 IHC를 결합하여 뇌간 망상 형성에서 저농도 mRNA(갈라닌 수용체 1, GalR1), 고농도 mRNA(글리신 수송체 2, GlyT2) 및 소포성 아세틸콜린 수송체(vAChT) 단백질¹⁰을 동시에 시각화했습니다.

고독관의 핵(NTS)은 자율 신경 기능에 관여하는 주요 뇌 영역입니다. 후뇌에 위치한 이 이질적인 뉴런 집단은 호흡을 조절하는 신호를 포함하여 방대한 수의 자율 신경 신호를 수신하고 통합합니다. NTS는 여러 신경 세포 집단을 보유하고 있으며, 이는 GalR1 및 GlyT2를 포함한 mRNA 표적의 발현 패턴과 효소 티로신 하이드록실라제(TH) 및 전사 인자 쌍 유사 호메오박스 2b(Phox2b)에 대한 단백질 마커에 의해 표현형적으로 특징지어질 수 있습니다.

RNAscope 소유자는 신선한 냉동 조직 준비를 권장하지만 고정 냉동 조직 절편의 장기 냉동 보호(-20°C에서 보관)와 함께 전체 동물 심내 관류 고정으로 준비된 조직은 많은 실험실에서 일반적입니다. 따라서 우리는 신선 냉동 및 고정 냉동 조직 제제를 사용하여 IHC와 함께 FISH에 대한 프로토콜을 수립하고자 했습니다. 여기에서는 신선 냉동 및 고정 냉동 뇌 절편을 제공합니다: (1) FISH 및 형광 IHC의 결합을 위한 프로토콜 (2) 각 제제를 사용할 때 생산된 mRNA 및 단백질 라벨링의 품질에 대한 설명 (3) NTS에서 GalR1 및 GlyT2의 발현에 대한 설명.

우리의 연구는 RNAscope 방법론과 결합했을 때 IHC의 성공은 신선 냉동 및 고정 냉동 제제에서 다양했으며 세포 내 표적 단백질의 국소화에 따라 달라진다는 것을 밝혔습니다. 우리 손에서는 멤브레인 결합 단백질 라벨링이 항상 성공적이었습니다. 대조적으로, 세포질 단백질에 대한 IHC는 형질전환 동물(Phox2b-GFP)에서 세포질 단백질이 과발현된 경우에도 문제 해결이 필요했습니다(Phox2b-GFP)¹¹. 마지막으로, GalR1은 NTS에서 비-카테콜아민성 뉴런에서 발현되는 반면, GlyT2 발현은 NTS에서 존재하지 않는다.

프로토콜

조직 전처리 단계의 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 모든 절차는 과학적 목적을 위한 동물의 사용 및 관리에 대한 지침(호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회)에 따라 뉴사우스웨일즈 대학교의 동물 관리 및 윤리 위원회에 따라 수행되었습니다.

1. 신선 냉동 뇌 조직의 샘플 준비

1. 심 관류
   1. 헤파린화 (2500 U / L) 0.1M 인산염 완충액 (PB), pH 7.5를 준비합니다. 드라이 아이스와 에탄올을 혼합하여 드라이 아이스 에탄올 슬러리를 만듭니다. 이것은 약 -72 °C의 온도를 가지며 수확된 조직의 즉각적인 동결에 사용됩니다.
   2. 27.5인치 바늘 게이지를 사용하여 펜토바르비탈나트륨(70mg/kg, ip)으로 마취하여 성체 C57BL/6 및 Phox2b-GFP¹¹(Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) 마우스를 안락사시킵니다.
      주의: 펜토바르비탈은 바르비투르산염입니다. 과다 복용 시 급성 독성이 있으며 호흡 정지로 사망할 수 있습니다. 사용하기 전에 현지 의료, 법률 및 물질 안전 지침을 참조하십시오.
   3. 심장을 노출시키고 드로잉 업 바늘(23인치 게이지)로 좌심실을 캐뉼레이션합니다. 0.1-1mL/분의 유속으로 혈액이 맑아질 때까지(2-3분) 헤파린화된 13M PB로 심경 관류를 수행합니다. 간의 착색과 우심방의 삼출액을 모니터링하여 혈액 청소를 결정합니다¹².
   4. 두개강에서 뇌를 분리하고 즉시 크라이오몰드 또는 알루미늄 호일에 넣어 최적 절단 온도 화합물(OCT)에 넣고 드라이아이스 에탄올 수조에 놓습니다. 냉동 내장 조직을 -80°C의 밀폐 용기에 최대 3개월 동안 보관합니다.
2. 신선 냉동 조직의 절편
   1. 저온 유지 장치 온도를 -20°C로 설정합니다. OCT가 내장된 조직과 저온 유지 장치 척을 저온 유지 장치에 ~30분 동안 두어 새 온도와 평형을 이룹니다.
      알림: 조직을 항상 냉동 상태로 유지하십시오. -80°C 냉동고에서 드라이아이스로 조직을 저온 유지 장치로 운반합니다.
   2. OCT 화합물을 사용하여 미리 냉각된 저온 유지 장치 척에 조직을 고정합니다. 이 프로토콜에서는 조직 블록이 코로나 평면의 척에 장착되었습니다.
      알림: 면도날을 사용하여 조직에서 과도한 OCT를 잘라내어 저온 유지 장치에 의해 절단된 OCT의 양을 최소화하고 유리 슬라이드로 옮깁니다.
   3. 14μm 두께의 코로나 절편을 절단하여 하전된 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
      1. 섹션을 장착하기 전에 슬라이드를 실온으로 데우십시오. 섹션이 장착되면 슬라이드를 저온 유지 장치의 슬라이드 상자에 보관합니다.
      2. 하나의 슬라이드에 둘 이상의 섹션을 장착해야 하는 경우 슬라이드의 반대쪽에 손가락을 5-10초 동안 놓아 섹션을 슬라이드에 고정하는 데 도움을 주어 두 번째 섹션의 영역을 따뜻하게 합니다. 차가운 티슈 섹션은 차가운 미끄럼틀에 부착되지 않습니다. 섹션은 슬라이드에 평평하게 부착되어야 합니다. 접으면 세탁 단계에서 슬라이드에서 떨어질 수 있습니다.
      3. 섹션에 균열이 발견되면 이를 방지하기 위해 저온 유지 장치 온도를 1-5°C 높이십시오. 조직 절편을 동일한 슬라이드에서 서로 가깝게 배치하는 것이 특히 중요합니다. 이렇게 하면 분석 중 FISH 프로브 및 시약의 낭비를 방지할 수 있습니다.
   4. 유리 슬라이드에 장착된 티슈 절편을 -80°C의 밀폐 용기에 담아 최대 6개월 동안 보관합니다.
      알림: RNA 분해를 방지하기 위해 섹션을 항상 냉동 상태로 유지하고 동결 해동 주기를 피하십시오. 슬라이드 박스를 냉동 유지 장치 내부에서 드라이아이스로 -80°C 냉동고로 운반합니다.
3. 신선한 냉동 조직의 고정
   1. FISH 프로브 분석을 수행할 당일에 0.1M PB, pH 7.5(4% PFA 용액)에서 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다. Buchner 깔때기 또는 도가니 필터에서 여과지(1등급: 11μm, 재료 표)를 통과시켜 필터링합니다.
      주의 : PFA는 피부 접촉이나 흡입에 의해 유해하고 독성이 있습니다. PFA 용액을 사용하는 모든 절차는 흄 후드 캐비닛에서 수행해야 합니다. PFA 용액 폐기물은 기관 안전 프로토콜에 따라 신중하게 처리해야 합니다.
   2. 4% PFA 용액을 4°C로 식힙니다. -80°C 냉동실에서 슬라이드 장착 티슈를 드라이아이스에 담아 운반하고 즉시 미리 식힌 정착액에 15분 동안 담그십시오.
      알림: 과도하게 고정하면 불특정 배경 라벨링이 발생하므로 이 고정 단계는 15분을 초과하지 않는 것이 중요합니다.
4. 신선 냉동 조직의 탈수
   1. 슬라이드를 등급별 농도의 에탄올에 담가 조직 절편을 탈수합니다. 코플린 병에 먼저 50%, 70%, 마지막으로 절대 에탄올을 실온에서 각각 5분 동안 담그십시오. 최종 절대 에탄올 배양을 두 번째로 반복합니다.
   2. 공기 건조 슬라이드와 소수성 배리어 펜을 사용하여 섹션 그룹의 윤곽을 그려 내부 영역이 최소한으로 유지되도록 합니다.
      알림: 소수성 장벽을 그리기 전에 유리 슬라이드가 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 소수성 장벽은 틈 없이 조직 절편을 완전히 둘러싸야 하며 추가 처리 전에 건조되어야 합니다.

2. 고정된 동결 뇌 조직의 샘플 준비

1. 심내막 관류 고정
   1. 펜토바르비탈나트륨(70mg/kg, i.p)으로 마취한 후 먼저 0.1M PB로 심내준 다음 4% PFA 용액으로 심 관류하여 마우스를 안락사시킵니다. 11-13mL/분에서 10분 동안 관류하여 고정합니다.
   2. 관류 고정 후 두개골강에서 뇌를 분리하고 4°C에서 4% PFA 용액에 밤새 담그십시오.
2. 고정 조직의 조직 절편
   1. 미세한 집게를 사용하여 해부 현미경을 사용하여 수막층을 제거하기 전에 멸균 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS)로 뇌를 헹굽니다.
   2. 뇌 매트릭스(재료 표)를 사용하여 뇌를 블록으로 정밀하게 절단합니다(비브라톰 절편 전에 뇌간을 전뇌에서 분리). 구체적으로는 피라미드 모양의 뇌간을 꼬리 모양으로 자르고 소뇌를 절개한다. 마찬가지로, 시신경 chiasm에 즉시 전뇌를 자릅니다.
   3. 시아노아크릴레이트를 사용하여 진동하는 마이크로톰 척에 조직을 고정하고 2% 한천 용액에 넣습니다.
   4. 진동 마이크로톰을 사용하여 30μm 두께의 조직 절편을 절단하고 절단된 절편을 동결 보호제 용액(30% RNase free sucrose, 30% 에틸렌 글리콜, 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP-40), 0.1M PB, pH 7.4)에 보관합니다. 조직 절편은 -20°C에서 최대 6개월 동안 동결 보호제에 보관할 수 있습니다.
3. FISH 전에 고정 섹션 준비
   1. FISH의 당일에는 세척 당 10 분 동안 부유 부분을 3 회 세척하여 동결 보호 용액을 제거합니다. 세척하려면 12웰 세포 배양 플레이트에 0.1M PBS의 절편을 놓고 회전하는 플랫폼 셰이커(90 - 100rpm)에서 교반합니다.
   2. 세척 후 페인트 브러시를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하고 최소 2시간 동안 자연 건조합니다.
      알림: 섹션은 슬라이드에 평평하게 부착되어야 하며, 접힌 부분이 있으면 세탁 중에 분리될 수 있습니다.
   3. 소수성 배리어 펜을 사용하여 섹션 주위에 장벽을 그려 FISH 시약을 섹션으로 제한합니다. 다시 한 번, 배리어 펜으로 그린 윤곽선의 내부 영역을 최소화하는 것이 중요합니다.
      가능한 중단점: 절편을 실온에서 하룻밤 동안 보관하여 다음날 분석을 계속할 수 있습니다.

3. 물고기 분석

참고: 프로토콜의 나머지 부분은 신선 냉동 조직과 고정 냉동 조직 모두에 적용됩니다.

1. 하이브리드화 및 증폭 단계를 위한 시약과 기기를 준비합니다.
   1. 벤치탑 인큐베이터와 수조를 40°C로 설정합니다.
   2. 슬라이드를 배양하기 위해 가습되고 빛으로 보호되는 챔버를 준비합니다. 가습은 조직의 건조를 방지합니다 - 슬라이드는 습한 저장소 위에 안전하게 위치합니다. 이상적으로, 챔버는 견고한 폴리스티렌으로 만들어지며, 포화 수증기 분위기를 유지하기 위해 차광 및 밀폐 되어 있습니다. 챔버의 폐쇄는 움직임을 피하기 위해 최소한의 마찰에 의존합니다. 우리는 바닥에 젖은 실험실 물티슈(재료 표)가 늘어선 슬라이드 박스를 사용했습니다. 슬라이드 박스를 인큐베이터 안에 넣어 40°C로 예열합니다.
   3. 수조를 사용하여 50x 세척 버퍼(재료 표)와 프로브를 40°C로 10분 동안 데운 다음 실온으로 식힙니다.
   4. 1x 스톡 농도에서 1x 세척 버퍼 50L를 준비합니다.
   5. 프로브 혼합물 준비(재료 표): C1 프로브는 재고 농도에서 바로 사용할 수 있는 반면 C2 및 C3 프로브는 50배 농도로 배송되며 키트에 제공된 희석제로 희석해야 합니다.
      알림: 프로브 혼합물은 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 프로테아제 치료
   1. Protease III(Table of Materials)로 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 다운스트림 공정(프로브 혼합물, 증폭 용액, 차단 완충액 및 항체 혈청)의 프로테아제 III 및 배양 시약이 섹션을 완전히 덮는지 확인하십시오. 피펫 팁을 사용하여 소수성 장벽 내부의 전체 영역을 덮기 위해 시약을 섹션에 퍼뜨릴 수 있습니다.
   2. 큰 플라스틱 사각형 페트리 접시에 0.1M PBS로 매번 2분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다. 여기서는 245mm x 245mm 정사각형 생물검정 접시를 사용하였다(Table of Materials). 접시의 한쪽에서 잡고 부드럽게 3-5회 기울입니다. 세척 후 슬라이드에서 초과 0.1M PBS를 튕기고 즉시 다음 시약을 추가합니다. 티슈 부분을 건조시키지 마십시오.
      알림: 세척할 때마다 슬라이드는 실온의 용액에 담급니다. 이것은 모든 후속 세척 단계에 대한 워크플로입니다. 고정된 30μm 두께의 섹션은 14μm 두께의 섹션보다 슬라이드에서 더 쉽게 제거되며 세척 중에 부드럽습니다.
3. 하이브리드화 및 증폭
   1. 프로테아제 용액을 씻어낸 후 슬라이드를 가습되고 예열된 챔버에 넣습니다. benchtop 인큐베이터 내부에서 40°C에서 2시간 동안 프로브 혼합물(재료 표)로 섹션을 배양합니다.
      참고: 샘플 RNA 품질과 최적의 투과성을 평가하기 위해 양성 및 음성 대조군 프로브를 위해 최소 2개의 섹션이 따로 마련되어 있는지 확인하십시오. 양성 대조군 프로브는 가사 유전자를 표적으로 합니다. 여기서는 유비퀴틴 C(UBC, 고농도), 펩티딜프로필 이소머라제 B(PPIB, 중간 정도) 및 RNA 중합효소 2a(POLR2A, 저농도)를 표적으로 하는 RNA의 칵테일이었습니다. 음성 대조군 프로브는 일반적으로 쥐 뇌 샘플에는 없는 박테리아 4-하이드록시-테트라하이드로디피콜리네이트 환원효소(DapB) 유전자를 표적으로 합니다. 양성 DapB 신호는 샘플의 비특이적 신호 및/또는 박테리아 오염을 나타냅니다.
   2. 프로브 혼합물과의 혼성화 후 신호 증폭 단계는 각각 40°C에서 Amp 1-FL(30분), Amp 2-FL(15분), Amp 3-FL(30분) 및 Amp 4-FL(15분)을 사용한 배양으로 구성됩니다. 제공된 스포이드 병을 사용하여 증폭 용액으로 조직 부분을 덮습니다. 마지막 증폭 단계에 따라 IHC 분석을 진행합니다.
   3. 프로브 하이브리드화와 각 증폭 단계 사이에 2분 동안 세척 버퍼로 슬라이드를 두 번 헹굽니다.

4. IHC 분석

1. IHC 차단 단계
   1. 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 FISH 분석 후 1x TBSm(50mM Tris-Cl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05% merthiolate)에서 10% 정상 말 혈청, 0.3% Tween20을 포함하는 차단 용액으로 실온에서 절편을 1시간 동안 배양합니다. 1x TBSm, 5% 정상 말 혈청 및 0.1% Tween20을 포함하는 희석 완충액에 1차 항체를 준비합니다. 1차 항체 공급업체는 재료 표에 나열되어 있습니다.
2. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
   1. 슬라이드를 튕겨 과도한 차단 완충액을 제거하고 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체로 절편을 배양합니다.
   2. 슬라이드를 1x TBSm으로 3회(각 5분) 세척하고 1x TBSm, 1% 정상 말 혈청 및 0.1% Tween20을 함유한 희석액에 2차 항체를 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이 프로토콜에 사용되는 2차 항체는 재료 표에 나열되어 있습니다.
   3. DAPI(Table of Materials)를 사용하거나 사용하지 않고 장착 매체로 커버슬립하기 전에 3x TBSm(각 1분)으로 슬라이드를 5번 세척합니다.

5. 이미징

1. 카메라가 장착된 형광 현미경으로 면역염색을 검사합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 대표 이미지를 20배 배율로 획득하고 TIFF 파일로 저장할 수 있습니다.
2. 대표 이미지를 이미지 처리 소프트웨어(Table of Materials)로 내보내 밝기/대비를 조정하여 선명도를 높이고 실제 렌더링을 반영합니다.

6. 선택 사항: 표적 전사체의 정량 분석

참고: 이 기사는 방법 문서이며 정량적 결과는 제공되지 않습니다. 여기에 제시된 정량화 방법은 Dereli et al.에서 가져온 것입니다.¹⁰.

1. 5.1에 설명된 대로 관심 영역에서 이미지를 획득하고 동일한 형광단의 모든 이미지에 동일한 현미경 및 카메라 설정(예: 노출 시간 및 광도)을 적용합니다.
2. 이미지 분석 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 신경 세포 프로파일을 플로팅합니다.
3. 입체 뇌 아틀라스¹³에 따라 Bregma 수준을 참조하여 섹션을 정렬합니다.
4. 동일한 형광단의 모든 이미지에 동일한 밝기와 대비를 적용합니다. DAPI 염색 핵이 있는 뉴런만 고려하십시오.
5. 관심 영역 내에서 mRNA, 단백질 발현, mRNA/mRNA, 단백질/단백질 및 mRNA/단백질 동시 발현 세포의 수를 수동으로 계산합니다.
6. 실험 결과의 편향을 줄이려면 실험 결과를 정량화하는 사람이 실험 그룹에 대해 눈가림을 받도록 합니다.
7. 다음 Abercombie 방정식을 사용하여 Abercrombie 보정¹⁴ 를 총 세포 수에 적용합니다.
   수정된 셀 수 = 수동 셀 수 x 단면 두께 / (단면 두께 + 핵 크기)
   예를 들어, 14μm 두께의 단면에 대하여, 평균 핵 폭은 7.7 ± 0.3 μm로 계산되고, 평균 단면 두께는 14 ± 1 μm로 계산되며, 5마리의 동물(10)에서 각각 30개의 세포 및¹⁰개의 단면을 기준으로 한다. Abercrombie 방정식에 따르면 수정된 셀 수는 수동 셀 수 x 14/(14+7.7)입니다.

그림 1: 신선 냉동 조직과 파라포름알데히드 고정 조직 모두에 대한 조직 전처리 단계의 병렬 워크플로우. 신선 냉동 조직의 처리 단계는 빨간색 윤곽선이 있는 상자에 표시되는 반면, 파라포름알데히드(PFA) 고정 조직의 처리 단계는 파란색 윤곽선이 있는 상자에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 결합된 FISH 프로브와 면역조직화학 절차의 요약. 조직 전처리 후, 첫 번째 프레임에서 볼 수 있듯이 슬라이드 장착 조직을 소수성 배리어 펜을 사용하여 둘러싸고 실온에서 프로테아제 용액에서 배양합니다. 세척 후, 조직을 순차적 증폭 단계 전에 2시간 동안 하이브리드화를 위해 벤치탑 인큐베이터로 옮깁니다. in situ hybridization 시스템은 프레임 3-6⁶에서 볼 수 있듯이 독점적인 'Z 프로브' 설계, 프리앰프 및 앰프를 활용합니다. 조직이 FISH 프로브 처리를 거치면 일반 말 혈청으로 차단하기 전에 세척합니다. 1차 항체 배양은 항체-항원 결합을 최대화하기 위해 4°C에서 밤새 수행됩니다. 2차 항체 배양(2시간)은 실온에서 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

여기에서는 마우스 NTS에서 각각 신선 냉동 및 파라포름알데히드 고정 조직을 사용하여 GalR1 및 GlyT2에 대한 mRNA 발현을 국소화하기 위해 멀티플렉스 FISH와 형광 IHC를 결합하는 방법을 간략하게 설명합니다. 분석법에 설명된 조직 처리, FISH 및 IHC 절차의 파이프라인은 그림 1 및 그림 2에 표시되어 있습니다. 표 1 은 각 그림에 사용된 FISH 프로브 및 항체 조합에 대한 요약을 제공합니다.

대조군 프로브는 워크플로우의 무결성을 보장하고 시료 품질을 확인하기 위해 표적 프로브와 동시에 일상적으로 분석됩니다. DapB 라벨링이 없으면 건전한 조직 품질과 무결성, 박테리아 오염이 없음을 확인할 수 있습니다(그림 3A). 유비퀴틴 C(UBC, 높은 존재비), 펩티딜프로필 ...

토론

신경 과학에서 FISH와 IHC는 신경 하위 집단 내에서 mRNA 또는 단백질의 공간 조직 및 기능적 중요성을 조사하는 데 일상적으로 사용됩니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 뇌 절편에서 mRNA와 단백질을 동시에 검출할 수 있는 능력을 향상시킵니다. 당사의 결합된 다중 FISH-IHC 분석은 신선 냉동 및 고정 뇌 제제 모두에서 NTS의 뚜렷한 신경 하위 집단의 표현형 식별을 가능하게 했습니다. 고정 냉동 조직 제제에서 FISH-IHC는 신뢰할 수 있는 IHC 결과를 생성했습니다. 예를 들어, 저농도 및 고농도 mRNA(각각 GalR1 및 GlyT2) 및 IHC(표적 티로신 하이드록실라아제)에 대한 멀티플렉스 FISH는 GalR1 및 GlyT2가 비카테콜아민성 NTS 뉴런에서 발현됨을 밝혔습니다. TH에 대한 IHC는 신선 냉동 조직에서 성공하지 못했으며, 이는 신선 냉동 제제에서 FISH-IHC의 제한된 용량을 강조합니다.

ISH는 다양한 시나리오에서 IHC보다 더 적합할 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ANIMALS
C57BL/6 마우스	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 2159769
Phox2b-eGFP 마우스	Australian BioResources, Moss Vale	MGI: 5776545
REAGENTS
Cyanoacrylate	Loctite
에틸렌 글리콜	시그마-알드리치	324558
헤파린-나트륨	클리포드 할람 헬스케어	1070760	지역 수의사 공급업체 또는 약국에 문의하십시오.
Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) 안락사 주사	Virbac (Australia) Pty Ltd	N/A	펜타바르비톨 나트륨에 관한 현지 제약 규정에 대해서는 수의사와 상담하십시오
. 분자 등급 아가로스 분말	Sigma Aldrich	5077
OCT Compound, 118mL	Scigen Ltd	4586
파라포름알데히드, 프릴, 95%	Sigma-Aldrich	441244-1KG
폴리비닐피롤리돈, 평균 mol wt 40,000  (PVP-40)	Sigma-Aldrich	PVP40
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930	DAPI
RNAscope Multiplex 형광 시약 키트(최대 3-plex 기능)	Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD Bio)	ADV320850	50x 세척 버퍼 및 Protease III
RNase Away	포함 Thermo-Fisher Scientific	7003
Tris(하이드록시메틸)아미노메탄	Sigma-Aldrich	252859
Tween-20, 분자 생물학용	Sigma-Aldrich	P9416
EQUIPMENT
Benchtop 인큐베이터	Thermoline 과학용 마이크로 인큐베이터	모델: TEI-13G
Brain Matrix, 마우스, 30g 성인, 관상용, 1mm	Ted Pella	15050
저온 유지 장치	Leica	CM1950
드로잉 업 바늘 (23 인치 게이지)	BD	0288U07
소수성 배리어 펜	벡터 연구소	H-4000
Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이프	Kimberley Clark Professional	34120
Olympus BX51	Olympus	BX-51
연동 펌프	Coleparmer Masterflex	L/S 시리즈
Retiga 2000R 디지털 카메라	QImaging	RET-2000R-F-CLR	컬러 카메라
SuperFrost Plus 유리 슬라이드(흰색)	Thermo-Fisher Scientific	4951PLUS4
진동 마이크로톰(비브라톰)	Leica	VT1200S
Whatman 정성 여과지, 1등급, 직경 110mm	Merck	WHA1001110
소프트웨어
CorelDRAW	Corel Corporation	버전 7
FIJI (ImageJ 배포)	오픈 소스/GNU General Public Licence (GPL)	N/A	ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; 쉰델린, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    피지: Schindelin, J.; 아르간다-카레라스, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019
PRIMARY ANTIBODIES
anti-Tyrosine Hydroxylase 항체	Millipore Sigma	AB1542	Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755
anti-tyrosine Hydroxylase 항체, clone LNC1	Millipore Sigma	MAB318	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528
anti-vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) 항체	Sigma-Aldrich	ABN100	Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394
GFP 항체	Novus Biologicals	NB600-308	Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058
Phox2b 항체 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-376997	Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID:
AB_2813765SECONDARY ANTIBODIES
Alexa Fluor 488 AffiniPure 당나귀 안티-래빗 IgG (H+L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152	당나귀 항토끼 (1:400 희석), RRID:
AB_2313584 AMCA AffiniPure 당나귀 항양 IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-155-147	당나귀 항양 (1:400 희석), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure 당나귀 항염소 IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	705-175-147	당나귀 안티 염소 (1:400 희석), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151	당나귀 안티 마우스 (1:400 희석), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 양 IgG (H+L) (최소 X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)	Jackson ImmunoResearch	713-175-147	당나귀 안티 쉽 (1:400 희석), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe	ACDBio	448821-C1	targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Glycine transporter 2 oligonucleotide probe	ACDBio	409741-C3	표적 bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)
Phox2b 올리고뉴클레오티드 프로브	ACDBio	407861-C2	표적 bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)