이 프로토콜은 다중 표지 FISH 및 형광 IHC 신호를 달성하는 것을 목표로 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 절편 모두에서 형광 in situ hybridization(FISH)과 형광 면역조직화학(IHC)을 결합하는 방법을 설명합니다. IHC는 세포질 및 막 부착 단백질을 표적으로 삼았습니다.
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방법 논문
Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)
이 논문에서
요약
초록
형광 in situ hybridization(FISH)은 세포 내 특정 RNA 전사체의 존재 및 공간 분포를 식별하는 분자 기술입니다. 기능적으로 식별된 뉴런의 신경화학적 표현형은 일반적으로 면역조직화학(IHC)을 사용하는 여러 항체(표적 단백질)와의 동시 표지와 현장 교잡(표적 RNA)의 최적화를 동시에 필요로 합니다. 특정 뉴런을 특성화하기 위한 "신경화학적 서명"을 달성할 수 있지만 복잡한 요인에는 방법을 결합하기 전에 FISH 및 IHC 표적을 확인해야 할 필요성과 동일한 조직 섹션 내에서 동시에 표적화될 수 있는 제한된 수의 RNA 및 단백질이 포함됩니다.
여기서는 RNAscope FISH와 형광 면역염색을 각각 사용하여 동일한 뇌 절편에서 여러 mRNA와 단백질을 검출하는 신선 냉동 및 고정 마우스 뇌 제제를 모두 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 면역조직화학적으로 확인된 뇌간 핵에서 저농도 mRNA(예: 갈라닌 수용체 1)와 고농도 mRNA(예: 글리신 수송체 2)의 발현 패턴을 설명하기 위해 결합된 방법을 사용합니다.
FISH 분석의 다운스트림 단백질 라벨링에 대한 주요 고려 사항은 조직 준비 및 FISH 프로브 라벨링의 최적화를 넘어섭니다. 예를 들어, 항체 결합 및 표지 특이성은 FISH 프로브 분석 내에서 단백질 분해 효소 단계에 의해 해로운 영향을 받을 수 있음을 발견했습니다. 프로테아제는 펩타이드 결합의 가수분해 절단을 촉진하여 FISH 프로브가 세포에 쉽게 진입할 수 있도록 하지만, 후속 IHC 분석에서 표적이 되는 단백질을 분해하여 표적 결합을 생성할 수도 있습니다. 표적 단백질의 세포 내 위치는 FISH 프로브 분석 후 IHC 성공에 기여하는 또 다른 요소입니다. 표적 단백질이 막 결합되어 있을 때 IHC 특이성이 유지되는 것을 관찰한 반면, IHC 표적 세포질 단백질은 광범위한 문제 해결이 필요했습니다. 마지막으로, 슬라이드 장착형 고정 냉동 조직의 취급이 신선 냉동 조직보다 더 어렵다는 것을 발견했지만, RNAscope와 결합했을 때 IHC 품질은 고정 냉동 조직에서 전반적으로 더 좋았습니다.
서론
신경화학적으로 뉴런의 하위 집단을 정의하는 단백질과 mRNA는 일반적으로 각각 면역조직화학(IHC) 및/또는 제자리 교잡(ISH)의 조합으로 식별됩니다. ISH와 IHC 기법을 결합하면 다중 라벨링 용량을 극대화하여 기능적 뉴런(신경화학적 코딩)에 고유한 공동 국소화 패턴의 특성화를 용이하게 할 수 있습니다.
RNAscope를 포함한 형광 ISH(FISH) 분석법은 방사성 ISH 및 비방사성 발색 ISH와 같은 이전 RNA 검출 방법에 비해 감도와 특이도가 더 높습니다. FISH는 단일 mRNA 전사체를 반점 염색 지점으로 시각화할 수 있습니다1. 또한 RNAscope 분석을 통해 다양한 형광단 태그를 사용하여 한 번에 더 많은 수의 RNA 표적을 라벨링할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고 기술적 한계는 단일 실험에서 사용할 수 있는 형광단/염색체의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 현미경 필터 세트의 가용성이 포함됩니다. 이러한 고려 사항은 신경화학적 식별이 FISH와 IHC를 결합한 것을 사용할 때 각 기술을 개별적으로 사용하는 것과 비교할 때 복잡해지는데, 이는 한 방법에 최적화된 고유한 단계가 다른 방법에 해로울 수 있기 때문입니다.
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프로토콜
조직 전처리 단계의 요약은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 모든 절차는 과학적 목적을 위한 동물의 사용 및 관리에 대한 지침(호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회)에 따라 뉴사우스웨일즈 대학교의 동물 관리 및 윤리 위원회에 따라 수행되었습니다.
1. 신선 냉동 뇌 조직의 샘플 준비
- 심 관류
- 헤파린화 (2500 U / L) 0.1M 인산염 완충액 (PB), pH 7.5를 준비합니다. 드라이 아이스와 에탄올을 혼합하여 드라이 아이스 에탄올 슬러리를 만듭니다. 이것은 약 -72 °C의 온도를 가지며 수확된 조직의 즉각적인 동결에 사용됩니다.
- 27.5인치 바늘 게이지를 사용하여 펜토바르비탈나트륨(70mg/kg, ip)으로 마취하여 성체 C57BL/6 및 Phox2b-GFP11(Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) 마우스를 안락사시킵니다.
주의: 펜토바르비탈은 바르비투르산염입니다. 과다 복용 시 급성 독성이 있으며 호흡 정지로 사망할 수 있습니다. 사용하기 전에 현지 의료, 법률 및 물질 안전 지침을 참조하십시오. - 심장을 노출시키고....
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결과
여기에서는 마우스 NTS에서 각각 신선 냉동 및 파라포름알데히드 고정 조직을 사용하여 GalR1 및 GlyT2에 대한 mRNA 발현을 국소화하기 위해 멀티플렉스 FISH와 형광 IHC를 결합하는 방법을 간략하게 설명합니다. 분석법에 설명된 조직 처리, FISH 및 IHC 절차의 파이프라인은 그림 1 및 그림 2에 표시되어 있습니다. 표 1 은 각 그림에 사용된 FISH 프로브 및 항체 조합에 대한 요약을 제공합니다.
대조군 프로브는 워크플로우의 무결성을 보장하고 시료 품질을 확인하기 위해 표적 프로브와 동시에 일상적으로 분석됩니다. DapB 라벨링이 없으면 건전한 조직 품질과 무결성, 박테리아 오염이 없음을 확인할 수 있습니다(그림 3A). 유비퀴틴 C(UBC, 높은 존재비), 펩티딜프로필 .......
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토론
신경 과학에서 FISH와 IHC는 신경 하위 집단 내에서 mRNA 또는 단백질의 공간 조직 및 기능적 중요성을 조사하는 데 일상적으로 사용됩니다. 이 연구에서 설명된 프로토콜은 뇌 절편에서 mRNA와 단백질을 동시에 검출할 수 있는 능력을 향상시킵니다. 당사의 결합된 다중 FISH-IHC 분석은 신선 냉동 및 고정 뇌 제제 모두에서 NTS의 뚜렷한 신경 하위 집단의 표현형 식별을 가능하게 했습니다. 고정 냉동 조직 제제에서 FISH-IHC는 신뢰할 수 있는 IHC 결과를 생성했습니다. 예를 들어, 저농도 및 고농도 mRNA(각각 GalR1 및 GlyT2) 및 IHC(표적 티로신 하이드록실라아제)에 대한 멀티플렉스 FISH는 GalR1 및 GlyT2가 비카테콜아민성 NTS 뉴런에서 발현됨을 밝혔습니다. TH에 대한 IHC는 신선 냉동 조직에서 성공하지 못했으며, 이는 신선 냉동 제제에서 FISH-IHC의 제한된 용량을 강조합니다.
ISH는 다양한 시나리오에서 IHC보다 더 적합할 .......
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감사의 글
이 연구는 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 보조금 DP180101890와 Rebecca L Cooper Medical Research Foundation 프로젝트 보조금 PG2018110
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 마우스 | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP 마우스 | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| 에틸렌 글리콜 | 시그마-알드리치 | 324558 | |
| 헤파린-나트륨 | 클리포드 할람 헬스케어 | 1070760 | 지역 수의사 공급업체 또는 약국에 문의하십시오. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) 안락사 주사 | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | 펜타바르비톨 나트륨에 관한 현지 제약 규정에 대해서는 수의사와 상담하십시오 |
| . 분자 등급 아가로스 분말 | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| 파라포름알데히드, 프릴, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| 폴리비닐피롤리돈, 평균 mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | DAPI |
| RNAscope Multiplex 형광 시약 키트(최대 3-plex 기능) | Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD Bio) | ADV320850 | 50x 세척 버퍼 및 Protease III |
| RNase Away | 포함 Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(하이드록시메틸)아미노메탄 | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, 분자 생물학용 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop 인큐베이터 | Thermoline 과학용 마이크로 인큐베이터 | 모델: TEI-13G | |
| Brain Matrix, 마우스, 30g 성인, 관상용, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| 저온 유지 장치 | Leica | CM1950 | |
| 드로잉 업 바늘 (23 인치 게이지) | BD | 0288U07 | |
| 소수성 배리어 펜 | 벡터 연구소 | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이프 | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| 연동 펌프 | Coleparmer Masterflex | L/S 시리즈 | |
| Retiga 2000R 디지털 카메라 | QImaging | RET-2000R-F-CLR | 컬러 카메라 |
| SuperFrost Plus 유리 슬라이드(흰색) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| 진동 마이크로톰(비브라톰) | Leica | VT1200S | |
| Whatman 정성 여과지, 1등급, 직경 110mm | Merck | WHA1001110 | |
| 소프트웨어 | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | 버전 7 | |
| FIJI (ImageJ 배포) | 오픈 소스/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; 쉰델린, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z 피지: Schindelin, J.; 아르간다-카레라스, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| anti-Tyrosine Hydroxylase 항체 | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| anti-tyrosine Hydroxylase 항체, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| anti-vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) 항체 | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP 항체 | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b 항체 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: |
| AB_2813765SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 당나귀 안티-래빗 IgG (H+L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | 당나귀 항토끼 (1:400 희석), RRID: |
| AB_2313584 AMCA AffiniPure 당나귀 항양 IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | 당나귀 항양 (1:400 희석), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure 당나귀 항염소 IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | 당나귀 안티 염소 (1:400 희석), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) (최소 X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | 당나귀 안티 마우스 (1:400 희석), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 양 IgG (H+L) (최소 X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | 당나귀 안티 쉽 (1:400 희석), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | 표적 bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b 올리고뉴클레오티드 프로브 | ACDBio | 407861-C2 | 표적 bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
참고문헌
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al.
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