Method Article

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

 ,  , 
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 여러 생물학적 관련 저울에서 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공합니다. 시편의 3차원 무결성을 보존하도록 특별히 설계된 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 샘플 회전을 특징으로 하며, 발달 생물학에서 최선의 선택입니다. 예를 들어, 그들은 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터와 붉은 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타뉴움의전체 배아 형태 발생을 문서화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 유효한 많은 살아있는 화상 진찰 프로토콜은 단 하나 태아를 위한 단지 실험적인 프레임 워크를 제공합니다. 특히 비교 연구를 위해 순차적으로 이미지된 표본이 주변 분산의 영향을 받고 있기 때문에 이러한 접근 방식이 불편합니다. 또한, 이것은 주어진 시간 내에 분석될 수 있는 표본의 수를 제한한다. 당사는 샘플 챔버 기반 설정의 처리량을 증가시키고 따라서 모든 표본에 대해 유사한 주변 조건을 보장하는 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 첫째, 우리는 광 시트 형광 현미경에 대한 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 샘플 회전과 호환되는 다중 배아에 대한 장착 방법을 제안합니다. 셋째, Drosophila의예시적인 3차원 라이브 이미징 데이터 세트를 제공하며, 3개의 형질표시 핵과 트리볼륨을병치하여 동일한 트랜스유전자를 운반하는 3개의 트랜스제닉 서브라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 제공합니다. 우리의 프로토콜은 항상 순차적인 라이브 이미징에 항상 존재하는 주변 분산을 적극적으로 해결하므로 비교 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 이는 녹아웃 실험과 같은 비정상적인 표현형의 정량적 분석 및 특성화에 특히 중요합니다. 또한, 전체 처리량을 증가시킵니다, 이는 광시트 형광 현미경에 접근할 때 매우 편리하며, 이는 제한적이다. 마지막으로, 제안된 장착 방법은 기본적으로 최적화 노력이 없는 다른 곤충 종 및 추가 모델 유기체(예: 제브라피시)에 적응할 수 있다.

Introduction

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형광 현미경 검사는 특히 세포 및 발달 생물학에서 생명 과학에서 가장 필수적인 이미징 기술 중 하나입니다. 1990년대 중반부터 3차원 형광 영상에 대한 최첨단 형광 현미경1에서동일한 렌즈가 형광 발암 및 방출 광 검출에 사용된다. 조명 레이저 빔은 조명/검출 축을 따라 모든 형광을 자극하고 핀홀에 의해 검출되기 전에 각각의 초점이 벗어난 신호가 차별된다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 전체 표본이 조명됩니다. 따라서, 각 3차원 이미지, 즉 공간적으로 연속적인 2차원 이미지의 스택에 대해, 전체 표본은 12~수백배2의조명을 통해 광표백 및광독성3를촉진한다.

거의 20년 전, 광시트 기반 기술4는 3차원 형광 이미징을 위한 유망한 대안으로 등장하여 발달 생물학5에서귀중한 도구가 되었습니다. 이 접근 방식에서는 조명 및 감지가 분리됩니다. 조명 렌즈는 수직으로 배열된 검출 렌즈의 초점 평면 내에서 몇 마이크로미터의 깊이만 있는 라이트 시트를 생성하는 데 사용됩니다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 초점 평면 주위의 얇은 평면 부피만....

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Protocol

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1. 준비 작업

  1. 과학적 질문에 맞는 LSFM용 조명 렌즈/감지 렌즈/카메라 조합을 선택하고 현미경을 설정합니다. 시야의 크기는 카메라 칩 크기의 지수와 감지 렌즈의 배율입니다. 조명 렌즈는 전체 시야가 대략 평면 라이트시트(34)로덮여 있도록 선택해야 합니다. 권장되는 세 가지 조합은 표 1에나열됩니다.
  2. 아가로즈 알리쿼트 및 회수 접시를 준비하려면 2g의 저연아가로즈를 200mL 의 자동 수돗물에 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자레인지에 혼합물을 가열합니다. 1.5mL 또는 2mL 반응 튜브에 1mL 아가로즈 알리쿼트 몇 개 준비한 다음 아가로즈로 3-5mm 높이의 90mm Ø 페트리 요리를 채웁니다. 고형화된 알리코와 요리를 4°C에 보관하십시오.
  3. Drosophila의경우 : 신선한 사육 바이알을 준비하려면, 맞춤형 또는 시판 가능한 Drosophila 배지의 적절한 양을 요리하고, 넓은 유리병에 5-15 mL을 전송하고 4 ° C에 저장합니다. 달걀 누워 접시를 준비하려면 50mL의 오토클레이브 수돗물에 저용 아가로즈 1 g을 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자 레인지에 ....

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Results

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우리의 프로토콜은 샘플 챔버 기반 LSFM에서 비교 형광 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 예를 들어, 프레임워크는 두 종 이상의 종의 배아,(ii) 하나 이상의 유전자가 두개 이상의 유전자를 두드리고, (iii) 동일한 형질형 선의 다발배, (iv) 다른 형질대사로부터의 배아, 또는 동일한 트랜스젠선으로부터의 배아를 병치하는 데 사용될 수 있다. 그러나 다른 게놈 위치에서. 이 섹션에서는 마지막 두 시나리오에 대한 예제를 제공합니다.

우리의 첫번째 예시적인 응용프로그램에서, 우리는 대략 1일의 기간 동안 다른 형질전환 Drosophila 선(표 2)에서파생되는 3개의 태아의 형광 신호 역학을 보여줍니다(도 4, 보충 영화 1). 이러한 라인의 경우, 우리는 그들 모두가 다른 아마도 유비쿼터스 및 구성 활성 프로모터의 제어하에 핵 지.......

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Discussion

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LSFM의 독점적 인 응용 분야 중 하나는 발달 생물학입니다. 이 분야에서, 살아있는 표본을 보는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 형태 유전학 과정은 동적 방식으로 설명 될 수 없다. 여기에 설명된 바와 같이 샘플 챔버 기반 LSFM에서 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크는 두 가지 주요 이유로 편리합니다.

순차적인 라이브 이미징에서 피할 수 없는 주변 분산은 적극적으로 해결할 수 있습니다. 곤충 배아 관련 라이브 이미징에서, 우리는 예를 들면, 다음 감수성을 봅습니다. 계란 수집 문화는 배아 수집시에 다른 나이를 가질 수 있습니다. 드로소필라에서,이것은 자손45의자질에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 적절히 비동기화된 배양으로 작업하는 것이 선택사항이지만 동기화된 문화와의 동시 이미징은 훨씬 더 편리합니다. 드로소필라와 트리볼륨기반의 대표적인 결과는 동기화된 계란 수집 배양에.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 자신의 자원을 사용할 수있는 기회뿐만 아니라 원고에 대한 자신의 귀중한 의견뿐만 아니라, 트리볼륨 라이브 이미징, 기술 지원을위한 스벤 플래스뿐만 아니라 일란 데이비스, 니콜 Grieder와 게롤드 슈비거블루밍 스톡 센터를 통해 자신의 형질전환 Drosophila 라인을 공유에 대한 자신의 자원을 사용할 수있는 기회에 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-웰 플레이트오렌지 사이언티픽4430500 
24-well plateOrange Scientific4430300Tribolium
35-mm Ø를 포함하는 실시간 이미징 전용; 페트리 접시Fisher Scientific153066Drosophila와 관련된 라이브 이미징 전용입니다.
90mm &오슬래시; 페트리 접시Fisher ScientificL9004575
100 µ m 메쉬 크기 세포 여과기BD Biosciences352360
250 µ m 메쉬 크기 체VWR International200.025.222-038Tribolium
300 µ를 포함하는 실시간 이미징 전용; m 메쉬 크기 체VWR International200.025.222-040Tribolium
710 µ를 포함하는 실시간 이미징 전용; m 메쉬 크기 체VWR International200.025.222-050Tribolium
800 µ를 포함하는 실시간 이미징 전용; m 메쉬 크기 체VWR International200.025.222-051Tribolium
405 고운 밀가루Demeter e.V.SP061006Tribolium
관련된 라이브 이미징에만 Drosophila / 맞춤형 Drosophila 매체를 포함하는 라이브 이미징에만 형
광 마이크로스피어, 1.0 µ m &오슬래시;Thermo Fisher ScientificT7282
비활성 건조 효모Genesee Scientific62-108
저용융 아가로스Carl Roth6351.2
좁은 바이알Genesee Scientific32-109Drosophilasmall 페인트 브러시와 관련된 라이브 이미징 전용
VWR International149-2121
차아염소산나트륨(NaOCl), ~12% 활성 ClCarl Roth9062.3주의: 차아염소산나트륨은 부식성
통밀가루Demeter e.V.입니다.SP061036Tribolium / 영국: 통밀 가루
와이드 바이알Genesee Scientific32-110Drosophila 관련된 라이브 이미징 전용
와 관련된 라이브 이미징 전용 상업적으로 이용 가능한 초파리 배지 Genesee Scientific 66-115 매체와

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

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