여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.
서론
꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지....
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프로토콜
1. 대량 꿀벌 추출 옵션 1 : 애벌레 자체 제거
- 꿀벌 여왕을 텅 빈 랭스트로스 프레임에 감금하고 그녀를 식민지로 돌려 보내십시오. 여왕이이 프레임에 24 시간 동안 알을 낳게하십시오.
- 빗 세포의 대부분에 새로 낳은 알이 포함되어 있는지 확인하기 위해 24 시간 후에 프레임을 확인하십시오. 여왕과 식민지에 따라 계란은 처음 24 시간 동안 잘 낳지 않는 경우가 있습니다. 이 경우 추가 24 시간을 허용하고 필요에 따라 시간을 조정하십시오.
- 24 시간 알을 낳는 기간이 지나면 여왕을 풀어주십시오. 프레임을 명확하게 표시하고 식민지로 되돌려 보내십시오.
- 여왕을 케이징 한 후 정확히 192 시간 (8 일) (처음 24 시간 이내에 정상적인 알을 낳는다고 가정하고, 8 일은 번식 직전 시점을 표시한다), 식민지에서 표시된 프레임을 제거하십시오. 모든 성인 꿀벌을 털어 내고 프레임을 하이브의 내부 조건 (34 ° C 및 50 % 상대 습도 (RH))과 일치하는 인큐베이터로 옮깁니다.
- 프레임의 대부분이 빗 세포의 바닥 가장자리에 단단히 밀착 된 크고 흰색의 C 자형 몸체로 인식 할 수있는 5번째 인스타 유충으로 채워져 있는지 확인하십시오. 특히 프레임의 중심 근처에 왁스 캡핑으로....
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결과
번데기 주사 및 바이러스 추출을위한 프로토콜 (그림 1)을 성공적으로 따르면 다량의 바이러스 입자가 생성되어야합니다. 그러나 여러 시점에서 다양한 콜로니에서 공급되는 번데기를 샘플링하고 주입하면 오염이 적은 표적 바이러스를 획득 할 가능성이 극대화됩니다. 꿀벌 내에서 바이러스가 복제되고 서로 상호 작용하는 역학은 잘 이해되지 않았습니다. 기존 감염의 가능성과 함께, 번데기가 동일한 원래 식민지에서 샘플링 된 경우에도 주사 된 (원하는) 바이러스가 주어진 번데기에서 우세해질 것이라는 보장은 없습니다. 그림 4는 추출 후 볼 수 있는 바이러스 비율의 잠재적 범위를 보여줍니다. 표시된 네 개의 콜로니는 모든 번데기가 처음에 ~ 95 %의 이스라엘 급성 마비 바이러스 (IAPV) 접종을 주입 한 더 큰 바이러스 수확 노력의 하위 집합을 나타냅니다. 이러한 추출에 관여하는 16개의 콜로니 샘플 중 10개는 일부 > 99%(예를 들어, 콜로니 1)를 .......
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토론
여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 정량화될 수 있다(도 5). 감염 능력 및/또는 병리학의 확인 후, 생성된 입자는 꿀벌과 꿀벌 바이러스 사이의 상호작용을 밝히기 위해 생물 검정에 사용될 수 있다.
기술된 프로토콜의 가장 독특한 이점 중 하나는 번데기 수확, 입자 생성 또는 생물학적 검정 수행 여부에 관계없이 각각이 대량으로 쉽게 스케일링된다는 것입니다. 번데기 절제 방법33을 사용하면 시간당 ~ 100 마리의.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
프로토콜 생성 과정에서 그녀의 아이디어와 토론에 대한 줄리아 파인 박사와 편집 전반에 걸쳐 도움이되는 의견을 주신 Cassondra Vernier 박사에게 감사드립니다. 이 자료들은 보조금 ID 549025에 따라 식량 농업 연구 재단이 부분적으로 지원하는 프로젝트에 기여했습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10% 표백제 용액 | |||
| 24:1 클로로포름:이소아밀 알코올 | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% 에탄올 용액 | |||
| 생물학적 분석 | 실험 설정에 따라 | ||
| 다름 Combitips Advanced 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | 옵션(주입기 appartus를 사용할 수 없는 경우) |
| 유충 자체 제거 | 대략 19" x 9-1/8"(Langstroth 딥 프레임 치수)를 측정해야 합니다. | ||
| 집게 | 유충 분리를 위한 뭉툭하고 부드러운 집게;번데기 절제를 위한 뭉툭하고 단단한 집게 | ||
| 흄 후드 | |||
| 인큐베이터 | 34 º을 유지할 수 있음; C 및 50% 상대 습도 | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | 모든 흡수성 물티슈가 작동합니다 |
| 중형 보트 | 접종 트레이로 사용 | ||
| Biomax 멤브레인이 있는 Microcon-100kDa | MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| 니트릴 장갑 | |||
| 인산염 완충 식염수(PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| 냉장 탁상형 원심분리기 | 15,000 x g | ||
| 냉장 원심분리기 | 21,000 x g | ||
| 리피터 M4 멀티피펫 | Eppendorf | 4982000322 | 옵션(주입기가 없는 경우) 사용 가능) |
| RNAse Away | , ThermoFisher | 7000TS1 | |
| RNAse-free water | SigmaAldrich | W4502 | |
| Sucrose | |||
| TES | , SigmaAldrich | T1375 |
참고문헌
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L.
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재인쇄 및 허가
