피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

요약

기존의 광혈전제 뇌졸중(PTS) 모델은 주로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 용해 치료에 대한 내성이 높은 고밀도 혈소판 응집체를 유도합니다. 여기서 변형된 쥐 PTS 모델은 광활성화를 위해 트롬빈과 감광성 염료를 함께 주입하여 도입됩니다. 트롬빈 강화 PTS 모델은 혼합 혈소판:피브린 응고를 생성하며 tPA 혈전용해에 매우 민감합니다.

초록

이상적인 혈전색전증 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 비교적 간단한 수술 절차, 일관된 경색 크기 및 위치, 환자와 유사한 혈소판:피브린 혼합 혈전의 침전, 섬유소 용해 치료에 대한 적절한 민감성 등 특정 특성을 필요로 합니다. 로즈 벵골(RB) 염료 기반 광혈전 뇌졸중 모델은 처음 두 가지 요구 사항을 충족하지만 혈소판은 풍부하지만 피브린이 부족한 혈전 구성으로 인해 tPA 매개 용해 처리에 매우 내화성이 있습니다. 우리는 중뇌동맥(MCA)의 근위 가지를 겨냥한 광활성화를 위한 RB 염료(50mg/kg)와 트롬빈(80U/kg)의 혈전 미만 용량의 조합이 피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 혈전을 생성할 수 있다고 추론합니다. 실제로, 트롬빈과 RB(T+RB)의 결합 광혈전증 모델은 면역염색 및 면역블롯에서 볼 수 있듯이 혼합혈소판:피브린 혈전을 유발하고 일관된 경색 크기와 위치와 낮은 사망률을 유지했습니다. 또한, 광활성화 후 2시간 이내에 tPA(Alteplase, 10mg/kg)를 정맥 주사하면 T+RB 광혈전증의 경색 크기가 유의하게 감소했습니다. 따라서, 트롬빈-강화 광혈전 뇌졸중 모델은 새로운 혈전용해 요법을 시험하기 위한 유용한 실험 모델이 될 수 있다.

서론

혈관 내 혈전제거술과 tPA 매개 혈전용해술은 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 급성 허혈성 뇌졸중 치료법 중 유일하게 두 가지로, 미국에서 매년 ~700,000명의 환자를 괴롭히고 있습니다¹. 혈전절제술은 대혈관 폐색(LVO)으로 제한되기 때문에 tPA 혈전용해술은 소혈관 폐색을 완화할 수 있지만, 둘 다 급성 허혈성 뇌졸중의 중요한 치료법이다². 또한, 두 치료법의 조합(예: 뇌졸중 발병 후 4.5시간 이내에 tPA-혈전용해술을 시작한 후 혈전절제술을 시행)은 재관류와 기능적 결과를 개선한다³. 따라서 혈전용해술을 최적화하는 것은 혈전제거술의 시대에도 뇌졸중 연구의 중요한 목표로 남아 있습니다.

혈전색전증 모델은 혈전용해 요법을 개선하는 것을 목표로 하는 전임상 뇌졸중 연구에 필수적인 도구입니다. 이는 기계적 혈관 폐색 모델(예: 내강 내 봉합사 MCA 폐색)은 혈전을 생성하지 않으며, 기계적 폐색 제거 후 대뇌 혈류의 빠른 회복이 지나치게 이상화되어 있기 때문이다 ^4,5. 현재까지 주요 혈전색전증 모델에는 ....

프로토콜

이 프로토콜은 버지니아 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 따릅니다. 그림 1A 는 이 프로토콜의 수술 절차를 간략하게 보여줍니다.

1. 수술 설정

1. 수술 최소 15분 전에 온도를 37°C로 설정한 보온 패드를 작은 동물 어댑터에 놓습니다. 동물 머리를 회전할 수 있는 어댑터용 노즈 클립 롤을 준비합니다. 마취제 케타민(60mg/kg)/자일라진(10mg/kg)을 준비합니다.
2. 가위, 집게, 마이크로 바늘 홀더, 지혈제, 면봉 및 봉합사를 포함한 수술 도구를 오토클레이브로 멸균합니다(121°C, 15psi에서 60분). 티슈 접착제와 눈 연고를 준비합니다. 외과 의사를 위한 532nm 레이저 보호 고글을 준비합니다.
   참고: 이 프로토콜은 주요 생존 수술 절차를 설명하며 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
3. 532nm 레이저 소스로 조명 시스템을 설정합니다. 치과 드릴을 준비하십시오.
4. 로즈 벵골 용액을 식염수(10mg/mL)로 준비합....

결과

먼저, RB와 T+RB 광혈전증 유발 혈전의 피브린 함량을 비교했습니다. 마우스는 광활성화 후 2시간에 고정제의 심경 관류에 의해 희생되었고, 뇌는 종평면 및 횡평면에서 MCA 가지의 면역형광 염색을 위해 제거되었습니다. RB 광혈전증에서 MCA 가지는 CD41⁺ 혈소판과 작은 피브린으로 조밀하게 채워져 있었습니다(그림 2A,C). 대조적으로, T+RB 광혈전증의 MCA 가지는 무작위로 혼합된 혈소판:피브린 응고에 의해 폐색되었습니다(그림 2B,D, 각각에 대한 n>3). 또한 면역블롯을 사용하여 광활성화 후 2시간에 식염수로 심 경관류를 한 후 두 모델 간의 대뇌 피질의 피브린(오겐) 수준을 비교했습니다. 이 분석은 RB 광혈전증> 비해 T+RB의 동측 반구에서 피브린 침착이 2배 증가했음을 보여주었습니다(

토론

1985년에 도입된 전통적인 RB 광혈전 뇌졸중은 간단한 수술 절차, 낮은 사망률 및 높은 뇌경색 재현성을 위한 국소 뇌허혈의 매력적인 모델입니다. ⁵ 이 모델에서, 광역학적 염료 RB는 광 여기시 혈소판을 빠르게 활성화하여 혈관을 막는 조밀 한 응집체를 유도합니다 ^5,8,23. 그러나, RB 유도 혈전 내 소량의 피브린(그림 2)은 허혈성 뇌졸중 환자에서 급성으로 회수된 혈전의 우성 혈소판:피브린 혼입 패턴에서 벗어난다^21,22. RB 유도 혈전의 낮은 피브린 함량은 tPA 용해 치료에 대한 회복력에도 기여할 수 있습니다 ^7,8,1.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)	Sigma	T8877	경색
4-0 나일론 모노필라멘트 봉합	LOOK	766B	수술 용품
5-0 실크 봉합	하버드 기구	624143	수술 용품
543nm 레이저 빔	Melles Griot	25-LGP-193-249	광혈전증
성인 수컷 마우스	Charles River	C57BL/6	10~14주령(22~30g)
마우스 어댑터 기계 공장용 마취 바	, UVA		수술 설정
Avertin(2, 2, 2-Tribromoethanol)	Sigma	T48402	안락사
치과 드릴	Dentamerica	Rotex 782	수술 설정
디지털 현미경	Dino-Lite	AM2111	뇌 영상
해부 현미경	Olympus	SZ40	수술 설정
미세 곡선 겸자 (톱니 모양)	FST	11370-31	수술 도구
미세 곡선 집게 (매끄럽게)	FST	11373-12	수술 도구
염소 안티 토끼 Alexa Fluro 488	Invitrogen	A11008	면역 조직 화학
Halsted-Mosquito 지혈 FST		13008-12	수술 기구
온난화 패드가 있는 히트 펌프	Gaymar	TP700	외과 설정
주입 펌프	KD Scientific	200	혈전용해 치료
인슐린 주사기 31G 바늘	BD	328291	광혈전증
케타민	CCM, UVA		마취
레이저 보호 구글 532nm	Thorlabs	LG3	광혈전증
케토 프로펜	CCM, UVA		NSAID 진통
마이크로 바늘 홀더	FST	12060-01	수술 기구
마이크로 가위	FST	15000-03	수술 기구
MoorFLPI-2 혈류 이미저	Moor	780nm 레이저 소스	레이저 반점 대비
이미징 마우스 어댑터	RWD	68014	수술 설정
Puralube Vet 연고	Fisher	NC0138063	안구 건조 예방
견인기 팁	Kent Scientific	Surgi-5014-2	수술 설정
Rose Bengal	Sigma	198250	광혈전증
Thrombin	Sigma	T7513	광혈전증
조직 접착제	Abbott Laboratories	NC9855218	수술 용품
tPA	Genetech	Cathflo 활성효소 2mg	혈전용해 치료
Vibratome	Stoelting	51425	TTC infacrt
Xylazine	CCM, UVA		마취

사 사