Method Article

세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양

DOI:

10.3791/61749

⸱

February 6th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

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우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.

Abstract

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안구 세균 감염은 시력에 위험합니다. 연구원은 가능한 치료 표적을 확인하고 실명을 방지하기 위하여 약을 시험하기 위하여 감염과 관련되었던 호스트 및 세균성 요인 및 면역 반응 통로를 조사하기 위하여 동물 모형을 이용합니다. 인트라비탈 주입 기술은 유기체, 약물 또는 기타 물질을 눈의 후방 세그먼트의 유리체 구멍에 직접 주입하는 데 사용됩니다. 여기에서, 우리는 마우스 눈에서 감염을 시작하는 이 주입 기술 및 안구 내 박테리아를 정량화하는 기술을 시연했습니다. 바실러스 세레우스는 뇌 심장 주입 액체 미디어에서 18시간 동안 재배되었고 농도 100콜로 다시 매립(CFU)/0.5 μL을 하였다. C57BL/6J 마우스는 케타민과 자일라진의 조합을 사용하여 마취되었다. 피콜리터 마이크로인젝터와 유리 모세관 바늘을 사용하여, 바실러스 현탁액의 0.5 μL은 마우스 눈의 중간 유리체에 주입되었다. 금방 대조눈은 멸균 매체(외과적 통제)로 주입되었거나 주입되지 않았다(절대 제어). 감염 후 10시간 동안, 마우스는 안락사되었고, 눈은 멸균 수술 핀셋을 사용하여 수확하고 400 μL 멸균 PBS 및 1mm 멸균 유리 구슬을 포함하는 튜브에 배치되었다. ELISA 또는 골수페록시다제 아사제의 경우, 단백질 효소 억제제가 튜브에 첨가되었다. RNA 추출의 경우 적절한 용해 버퍼가 추가되었습니다. 눈은 1-2 분 동안 조직 균질화로 균질화되었다. 균질화는 PBS에서 10배 연속적으로 희석되고 한천 판에 희석된 추적을 했다. 균질의 나머지 는 추가 적인 에세이를 위해 -80°C에 저장하였다. 플레이트는 24시간 동안 배양되었고 눈당 CFU가 정량화되었습니다. 이러한 기술은 마우스 눈에 재현 가능한 감염을 초래하고 실행 가능한 박테리아의 양을 용이하게, 숙주 면역 반응, 호스트 와 세균 성 유전자 발현의 omics.

Introduction

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세균성 내과염은 염증을 일으키는 치명적인 감염이며, 제대로 치료하지 않으면 시력이나 실명의 손실이 발생할 수 있습니다. 내피탈미염은1, 2,3,4,5의내부로박테리아가 들어온 결과. 일단 눈에, 박테리아 복제, 독 소 및 기타 유해 요인을 생산, 섬세 한 망막 세포와 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 안구 손상은 또한 염증에 의해 발생할 수 있습니다, 눈의 내부로 염증 세포 유입으로 이어지는 염증 경로의 활성화에 의해1,5,6. 내과 실증염은 안구 수술(수술 후), 눈에 관통하는 부상(외상 후), 또는 다른 해부학 부위(내인성)7,8,9,....

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Protocol

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모든 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을위한 비전과 안과 성명서에 대한 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드와 연구를위한 협회의 권고에 따라 수행되었다. 프로토콜은 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 15-103, 18-043 및 18-087).

1. 멸균 유리 바늘

  1. 바늘 파이펫 풀러를 켭니다.
  2. 디스플레이에 12.6이 표시될 때까지 히터 노브를 조정합니다.
  3. 튜브의 절반이 필라멘트(그림1A)아래로 확장될 때까지 도어를 열고 상부 클램프및 히터 필라멘트를 통해 5μL 모세관 튜브를 수동으로 공급한다.
  4. 모세관 튜브가 상부 클램프의 "V" 홈에 있는지 확인합니다. 상부 클램프를 조입니다.
  5. 하부 클램프를 열어 아래 쪽 클램프가 상한에 도달할 때까지 수직 슬라이드를 수동으로 조정합니다. 튜브가 하부 클램프의 "V" 홈에 있는지 확인합니다. 하부 클램프를 조입니다.
  6. 문을 닫고 '준비' 표시등이 켜져 있는지 확인합니다. 시작 버....

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Results

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인트라비탈 주사 절차의 재현 가능한 접종과 정확도를 생성하는 것은 미생물 내과막염의 모델을 개발하는 데 있어 중요한 단계입니다. 여기에서, 우리는 그람 양성 바실러스 세레우스를사용하여 인트라비티리얼 주입 절차를 시연했습니다. 우리는 5 개의 C57BL6 마우스의 중간 유리체에 B. cereus의 100 CFU/0.5 μL를 주입했습니다. 10 시간 후 소독 후, 우리는 약 1.8 x 105 CFU / 눈으로 B. 세레우스의 안구 내 성장을 관찰했다. 도 1은 마우스 눈의 중간 유리체로 박테리아를 전달하기 위해 유리 바늘의 건설을 보여줍니다. 혈액 한천 판과 배양 튜브에서 자라는 바실러스 세루는 도 2에도시된다. 도 3은 공기 가압 주입 시스템을 사용하여 마우스 내사 시사 절차를 나타낸다........

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Discussion

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강력한 항생제, 항염증제 및 비트레절제술 수술의 가용성에도 불구하고 세균성 내과염은 환자를 눈멀게 할 수 있습니다. 임상 연구는 폐막염을 연구하는 데 유용했습니다. 그러나, 폐염의 실험 모형은 환자를 위한 더 나은 시각적 결과의 결과로 배려의 표준에 있는 진행으로 번역될 수 있는 신속하고 재현가능한 결과를 제공합니다.

마우스 눈의 유리체 부피는 약 7 μL40이다. 이 작은 부피만 제한된 양의 재료를 주입할 수 있습니다. 1.0 μL 이상의 부피가 안구 손상을 피하기 위해 주입해서는 안됩니다. 이 프로세스는 재현성과 정확성을 보장하기 위해 특정 장비와 기술 관행이 필요합니다. 내과염은 영장류, 돼지, 토끼, 쥐, 기니 피그 및 마우스28,41,42,

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Disclosures

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저자는 공개 할 재정적 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 펭 리 박사와 마크 디트마르 (OUHSC P30 라이브 동물 이미징 코어, 딘 A. 맥기 아이 연구소, 오클라호마 시티, OK, 미국)에게 도움을 주셔서 감사합니다. 우리의 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원되었습니다 R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, 및 R01EY024140. 우리의 연구는 또한 P30EY21725 (살아있는 동물 화상 진찰 및 분석을 위한 NIH CORE 보조금, 분자 생물학 및 세포 화상 진찰)에 의해 지원되었습니다. 우리의 연구는 또한 NEI 비전 과학 전 박사 연수생 프로그램 5T32EY023202, 장로교 건강 재단 연구 지원 보조금 및 실명 방지를 위한 연구에서 딘 A. 맥기 눈 연구소에 무제한 보조금에 의해 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 &마이크로; L 피펫RANINL0696003GNA
37oC 인큐베이터Fisher Scientific11-690-625DNA
Bacto 뇌 심장 주입BD90003-032NA
세포 마이크로 주입기MicroData Instrument, Inc.PM2000NA
미세 팁 집게Thermo Fisher Scientific12-000-122NA
유리 구슬 1.0 mmBioSpec11079110NA
인큐베이터 셰이커New Brunswick ScientificNB-I2400NA
미세 모세관 피펫 5 마이크로 리터Kimble71900-5NA
마이크로 피펫 베벨러Sutter Instrument Co.BV-10NA
현미경 Axiostar PlusZeissNA
현미경 OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
다중 채널 피펫 30-300 &마이크로; LBiohit15626090NA
멀티채널 피펫 5-100 &마이크로; LBiohit9143724NA
바늘 / 피펫 풀러Kopf730NA
PBSGIBCO분자 등급
프로테아제 억제제 칵테일 Roche4693159001분자 등급
역 작용 겸자KatenaK5-8228NA
1897315

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

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