Method Article

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

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절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

Abstract

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실험실에서 배양한 조직이나 의료 기기를 개인에게 이식하는 성공 여부는 이식 숙주의 면역 반응에 달려 있습니다. 임플란트를 이물질로 간주하면 적대적이고 조절되지 않는 면역 반응은 임플란트의 거부 반응을 초래할 수 있는 반면, 조절된 반응과 항상성의 회복은 임플란트의 수용으로 이어질 수 있습니다. in vivo 또는 ex vivo 환경에서 해부된 임플란트의 미세환경을 분석하면 면역 반응 패턴을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 궁극적으로 차세대 생체 재료 개발에 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 세포 표면 마커를 기반으로 면역 세포와 그 하위 집합을 특성화하는 데 잘 알려진 기법입니다. 본 연구에서는 절개된 임플란트 조직에서 균일한 세포 현탁액을 분리하기 위해 세포 스트레이너를 통한 수동 다이싱, 효소 분해 및 여과를 기반으로 하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 유세포 분석을 통해 이러한 분리된 세포를 특성화하고 정량화하기 위한 초기 유세포 분석기 설정 단계와 함께 multicolor 유세포 분석 염색 프로토콜이 설명되었습니다.

Introduction

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의학 분야의 발전으로 인해 손상된 조직의 기능 또는 재성장을 지원하기 위해 이식된 재료가 자주 사용되었다 1,2. 여기에는 심박 조율기, 재건 미용 임플란트 및 골절 고정에 사용되는 정형외과 플레이트와 같은 장치가 포함됩니다 3,4. 그러나 이러한 임플란트를 만드는 데 사용되는 재료와 임플란트가 이식되는 위치는 이러한 임플란트의 성공을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다 5,6,7. 이러한 임플란트는 이물질로서 숙주로부터 면역 반응을 일으켜 거부 반응 또는 내성을 유발할 수 있다8. 이 요인은 착상 후 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 생성하기 위한 생체 재료 연구를 주도했습니다 9,10,11,12.

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Protocol

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참고: 그림 1 은 유세포 분석 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다.

1) 시약 준비

  1. 효소 희석 및 조직 배양을 위한 배지를 준비합니다.
    1. 5mL의 RPMI 배지에 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충 용액을 넣고 잘 흔듭니다. 더 사용할 때까지 배지를 4°C에서 보관하십시오.
  2. 효소 용액의 부피를 계산합니다.
    참고: 효소 용액의 부피는 6웰 플레이트에서 깍둑썰기한 조직을 소화하는 데 필요한 효소(콜라겐분해효소 및 DNase I)를 포함하는 배지의 부피입니다. 샘플 수에 따라 다릅니다.
    1. 다음 방정식을 사용하여 필요한 부피를 계산하십시오.
      (분해할 시료 수) × 5mL의 무혈청 RPMI와 10mM HEPES 완충액
      참고: 예를 들어, 0.1-0.3g의 절개된 비장에 대해 5mL의 배지를 사용하여 효소 용액을 준비합니다. 이 원고에 기술된 효소 소화 프로토콜은 주로 뇌, 신장, 피부, 간, 폐, 비장, 근육을 포함하는 마우스에서 해부된 연조직(0.1 내지 1 g)과 합성 물질 또는 세포외 기질 단백질로 만들어진 피하 임플란트 주위의 캡슐을 위한 것이다. 단단한 연골 조직을 소....

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Results

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면역 분석을 위한 유세포 분석 패널의 개발 과정은 종종 기존 데이터 및 해당 분야의 문헌과 결과를 비교하는 데 의존합니다. 유세포 분석에서 집단이 어떻게 존재할 수 있는지에 대한 지식은 데이터의 적절한 해석에 매우 중요합니다. 어쨌든 개체군과 세포 유형은 조직마다 다르게 나타날 수 있으므로 약간의 변동성이 예상됩니다. 잘 정의된 대조 조직의 맥락에서, 이러한 염색 최적화는 잘 연구된 세포 유형을 가진 알려진 조직에 대해 평가될 수 있습니다. 그림 3 은 대조군 마우스 조직에 대한 14색 FACS의 결과를 보여줍니다. 이 경우, 비장은 염색된 모든 마커를 식별하고 염색이 기술적으로 기능적임을 보여주기 위해 사용되었습니다. 이 시점부터 미지의 조건에서 테스트하고, 형광단 선택에 확신을 갖고, 다양한 조직 소스에 대한 프로토콜을 최적화하는 것이 더 쉬워졌습니다. 도 3 .......

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Discussion

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본 연구에서는 균일한 세포 현탁액을 얻기 위해 생체재료 임플란트에서 세포를 분리하는 상세한 방법론을 기술한다. 또한 multicolor 유세포 분석을 위한 세포 현탁액을 염색하기 위한 자세한 프로토콜과 최적의 결과를 위해 유세포 분석기를 구성하는 단계가 제공되었습니다. 세포 분리 방법은 여러 단계를 포함할 수 있으며, 종종 수동 조직 절개 후 단백질 분해 효소를 사용한 효소 분해를 사용하여 조직의 세포외 기질을 해리하고 세포-세포 접합을 파괴하여 조직에서 개별 세포를 해방합니다. 분해 후, 남아 있는 파편을 제거하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포 변형과 같은 추가 처리가 필요합니다. 높은 수준의 파편 또는 다른 세포 유형(예컨대, 종양)을 갖는 일부 샘플은 밀도 분리 배지(23)의 사용을 통해 보다 철저한 클린업을 필요로 할 수 있다. 적절한 샘플 세척이 없으면 파편이나 관심 모집단을 가리는 다른 세포 집단으로 인해 데이터가 왜곡될 수 있습니다. 과도한 파편은 또한 세포분석기 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 생물 의학 이미징 및 생물 공학 연구소 (National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)를 포함한 NIH의 교내 연구 프로그램 (Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 면책 조항: NIH, 그 임원 및 직원은 회사, 제품 또는 서비스를 추천하거나 보증하지 않습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL 원뿔형 튜브Fisher Scientific14-432-22
6 웰 플레이트Fisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655고정만 용
소 혈청 알부민Millipore SigmaA7906FACS 준비용 염색 완충액
CD11b AF700Biolegend101222클론: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5Biolegend117325클론: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121클론: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207클론: Ba13
CD206 PEBiolegend141705클론: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778클론 : 104 / A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199클론 : GL1
CD8a BV421Biolegend100737클론 : 53-6.7
Comp Bead anti-mouseBD Biosciences552843보상 제어
DNase IMillipore Sigma11284932001Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I
)F4/80 PE/Cy7Biolegend123113클론: BM8
Fc 블록Biolegend101301클론: 93
고정/투과화 솔루션 키트BD Biosciences554714세포의 고정 및 투과화용.
HEPES 완충액Thermo Fisher15630080세포 배지를 보충하기 위한 완충액
LiberaseMillipore Sigma5401127001정제된 콜라겐 분해 효소 I 및 콜라겐 분해 효소 II
LIVE/DEAD 혼합물 Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo FisherL23105Viability dye
Ly6c AF488Biolegend128015Clone: HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633클론: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894클론: M5/114.15.2
인산염 완충액 식염Thermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176세포 배양 매체
Siglec F BV605BD Biosciences740388클론: E50-2440
V-bottom 96-well plate
세포 수

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

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