이 프로토콜은 알레르겐에서 내인성 지질의 제거를 설명하고, 열 어닐링과 결합 된 역단계 HPLC를 통해 사용자 지정 리간드로 교체. 31 P-NMR 및 원형 이크로이즘은 리간드 제거/로딩의 신속한 확인과 토착 알레르겐 구조의 회복을 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 주요 알레르겐은 Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 및 Fel d 1을 포함하여 소수성 지질과 같은 분자에 결합합니다. 이러한 리간드는 강하게 유지되며 면역 체계를 직접 자극하거나 알레르기 성 단백질의 생물 학적 특성을 변경하여 감쇠 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 변수를 제어하기 위해서는 내인성 바운드 리간드를 제거하고 필요한 경우 알려진 조성물의 지질을 대체하는 데 기술이 필요합니다. 바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1은 전통적인 기술을 사용하여 정제 할 때 내생 지질의 이질적 혼합물을 결합하는 큰 소수성 구멍을 둘러싸고 있습니다. 여기서는 역상 HPLC를 사용하여 이러한 지질을 제거한 다음 열 어닐링으로 아포 형태로 Bla g 1을 산출하거나 지방산 또는 인지질화물의 사용자 정의 혼합물로 재장전되는 방법을 설명합니다. 생화학적 분석과 이 프로토콜을 결합하면 지방산 화물이 Bla g 1의 열안정성 및 보철 저항을 크게 변화시키고 T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 속도에 대한 하류에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 재조합 및 천연 소스 모두에서 알레르겐을 연구할 때 본원에 설명된 것과 같은 지질 제거/재장전 프로토콜의 중요성을 강조한다. 이 프로토콜은 리포칼린(Mus m 1), PR-10(Bet v 1), MD-2(Der p 2) 및 우트로글로빈(Fel d 1)을 포함한 다른 알레르겐 가족에게 일반화되어 알레르기 반응에서 지질의 역할을 연구하는 귀중한 도구를 제공한다.
서론
알레르겐 데이터베이스를 조사한 결과 알레르겐은 알려진 모든 단백질 가족의 2%만에서 발견되는 것으로 나타났으며, 이는 일반적인 기능성 및 생체학적 특성이 알레르기성1에기여한다는 것을 시사한다. 이러한 특성 중, 지질 화물을 결합하는 능력은 알러지 원 들 사이에서 강하게 과대 대표되는 것으로 보이며, 이러한 화물이 민감화 과정1에영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 실제로, 브라질 너트 알레르겐 Ber e 1은 내인성 지질과 함께 완전한 감이 있는 잠재력2를실현하는 데 협력해야 한다는 것을 보여주었습니다. 이들 지질은 잠재적으로 mite 알레르겐 Der p 2 및 Der p 7에 의해 도시된 바와 같이 면역 체계를 자극할 수 있으며, 둘 다 LPS 결합 단백질3,4,5와함께 강한 구조적 동성학을 공유할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여 Derp 2 및 Der p 7은 세균지질을 결합하고 TLR4 매개 신호를 통해 숙주 면역 체계를 직접 자극하여 민감화 과정5,
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프로토콜
1. 블라 g 1 복제
- 바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1.0101 (잔류물 34-216)에 대한 유전자를 획득, MA 도메인의 단일 반복을 나타내는. 단순성을 위해, 블라 g 1은 전체 Bla g 1.0101 성적 증명서가 아닌이 단일 반복을 나타내는 작업 전반에 걸쳐 사용됩니다.
- 블라 g 1 유전자를 원하는 벡터로 서브클론한다. 본 연구에서는, 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 분열 부위에 결합된 N-말단 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 함유한 유전자는이전에설명된 바와 같이 발현을 위한 pGEX 벡터로 삽입되었다.
- 블라 g 1 pGEX 벡터를 BL21 DE3 대장균 세포로 변환합니다.
- 원하는 벡터의 10 ng/μL 스톡을 준비합니다.
- 제조업체가 제공한 BL21 DE3 세포의 50 μL과 10 ng/μL DNA 스톡의 1 μL을 결합합니다.
- BL21 DE3-DNA 혼합물을 얼음에 30분 동안 배양합니다. 42°C 수조로 1분 간 이동한 다음 즉시 얼음으로 다시 이동하여 1분 추가 로 배양합니다.
- 세포에 LB 매체의 200 μL을 추가하고 37°C에서 1h를 추가로 배....
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결과
친화도 크로마토그래피를 사용하여, 재조합 GST-Bla g 1은 세포 배양의 ~2-4 mg/L의 수율을 생성하여 높은 수준의 순도(도1A)로쉽게 분리되었다. 4°C에서 TEV 프로테아제를 사용하여 하룻밤 배양하면 GST 태그를 제거하기에 충분하여 ~24 kDa에서 최종 생성물을 산출합니다. 이 경우 유량 통과 및 세척 분획에 상당한 양의 GST-Bla g 1이 있어 글루타티온 수지 결합 용량을 초과한 것을 시사합니다. 샘플 로딩 및 용출의 수지 또는 여러 주기를 사용하면 이 문제에 대한 해결 이 문제가 해결될 수 있습니다.
블라g 1을 역상 C18 컬럼에 적용하면 독특한 용출프로파일(도 1B)을생성하고, 두 개의 큰 피크를 ~50% 버퍼 B에서, 그리고 결과 분획의 두 번째 큰 피크는 전자가 cleaved GST 태그에 대응하는 반면, 후자는 Blag 1에 대응하는 반면, 그 결과 분수의 두 번째 큰 피크를 나타낸다. .......
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토론
이 작품에 기재된 프로토콜은 블라g 1의 지질 결합 특성을 체계적으로 연구하기 위해 성공적으로 적용되었다. 이는 화물 결합, 열안정성 및 내구 처리 사이의 상관관계를 드러냈으며, 후자는 면역원성9,18에대한 잠재적 의미와 알려진 T세포 에피토프의 생성 감소와 상관관계가 있었다. 블라 g 1 외에도, Pru p 3 및 Bet v 1과 같은 다른 알레르겐은 표준 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피방법(13,19,20,21,22)을사용하여 정제될 때 내인성 바운드 화물을 유지하는 것으로 나타났다. 이 원치 않는 손님은 유사한 방식으로 이 단백.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 톰 커비 박사, 스콧 가벨, 그리고 로버트 런던 박사의 도움과 도움에 감사드리며, 밥 페트로비치 박사와 로리 에드워즈 박사와 함께 이 연구에서 사용되는 Bla g 1 구체를 생성하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 우리는 질량 분석에 대한 안드레아 아담스와 NMR 계측에 대한 지원을 유진 DeRose 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소, Z01-ES102906 (GAM). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 환경 보건 과학 연구소의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bla g 1 유전자 | Genescript | N/a | 맞춤형 유전자 합성 서비스. GenBank Accession AF072219 잔류물 없음 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | 실내 생명공학 | N/a | 맞춤 주문 |
| Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템 | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV 검출기, 펌프 및 탈기 장치 |
| Agilent DD2 600MHz 분광계 | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛 | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| 광대역 5mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| 디스스테아로일포스파티딜콜린(18:0 PC) | Avanti 극성 지질 | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 세포 | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 동결 건조 시스템 | Labconco | 7750000 | |
| 글루타티온 수지 | Genescript | L00206 | |
| 글루타티온, 환원 | Fisher Scientific | BP25211 | |
| 이소프로필-&베타;-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) | 피셔 사이언티픽 | 34060 | |
| Jasco CD 분광편광계 | Jasco | J-815 | |
| Millex 주사기 필터 유닛 | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - 유닉스 파이프를 기반으로 하는 다차원 스펙트럼 처리 시스템. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995년). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/A | 존슨, B.A. & Blevins, R.A. NMR View: NMR 데이터의 시각화 및 분석을 위한 컴퓨터 프로그램. J. 바이오몰. NMR 4, 603– 614 (1994년). |
| 올레산 | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA 단백질 분석 | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC 컬럼 | 애질런트 | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 진공 펌프 | Varian | VP-195 | |
| 소듐 콜레이트 수화물 | 시그마-알드리치 | C6445 | |
| 소듐팔미테이트 | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| 소듐스테아레이트 | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (소프트웨어) | Varian N/a |
참고문헌
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I.
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재인쇄 및 허가
