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방법 논문

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

5.8K 조회수

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DOI:

10.3791/61805

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2020년 10월 2일

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

이 논문에서

요약

우리는 피지-ImageJ를 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이를 정량화하는 보다 일관되고 신속한 방법을 설명합니다.

초록

유방암은 2019년에만 미국에서 40,000명의 여성 사망과 30%의 새로운 여성 암 진단을 차지하는 파괴적인 악성 종양입니다. 유방암 관련 죽음의 주요 원인은 전이성 부담입니다. 따라서 유방암을 위한 전임상 모델은 전이성 부담을 임상적으로 관련시키기 위해 분석할 필요가 있다. 4T1 유방암 모델은 단계 IV 인간 유방암을 위한 자발적으로 전이되고 정량화 가능한 마우스 모델을 제공합니다. 그러나, 대부분의 4T1 프로토콜은 조직 배양 판에 스테인드 콜로니를 수동으로 계수함으로써 전이성 부담을 정량화한다. 이는 전이성 부담이 낮은 조직에 충분하지만 수동 계산의 인간의 오류는 플레이트가 혼잡하고 계산하기 어려운 경우 일관성이 없고 가변적인 결과를 초래합니다. 이 방법은 인간 계수 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 제공합니다. 여기서, 우리는 4T1 모델에서 고전이성 조직인 폐를 이용한 프로토콜을 평가한다. 피지-ImageJ에서 분석을 위해 메틸렌 블루 스테인드 플레이트의 이미지를 획득하여 업로드합니다. 피지-ImageJ는 전이성 부담이 있는 플레이트의 백분율을 나타내는 파란색 이미지의 선택된 영역의 백분율을 결정합니다. 이 컴퓨터 기반 접근 방식은 고전이성 조직에 대한 수동 계수 또는 조직 병리학 평가보다 더 일관되고 신속한 결과를 제공합니다. 피지-ImageJ 결과의 일관성은 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이미지 간의 결과에 약간의 변화가 발생할 수 있으므로 여러 이미지를 촬영하고 결과를 평균화하는 것이 좋습니다. 최소한의 한계에도 불구하고,이 방법은 일관되고 신속한 결과를 제공함으로써 폐의 전이성 부담을 정량화하는 개선입니다.

서론

8명의 여자에 대하여 1개는 그녀의 일생에 있는 유방암으로 진단될 것입니다, 그러나 다중 처리 선택권에도 불구하고 유방암은 미국 여자에 있는 암 관련 죽음의 두 번째 주요한 원인입니다 1. 이 여자는 그들의 유방에 있는 1 차적인 종양에서 정지하지 않습니다. 대신, 전이성 부담은 일반적으로 폐, 뼈, 두뇌, 간 및 림프절2로퍼지기 때문에 이 질병의 사망에 책임 있습니다. 이 때문에 유방암 모델은 이 질병의 사망률을 억제하는 데 기여하기 위해 전이를 평가해야합니다. 4T1 뮤린 유방암 모델은 이를 달성하기 위한 훌륭한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 방법은 피지-ImageJ를 사용하여 폐 전이를 정량화하여 일관되고 신속한 결과를 생성함으로써 4T1 모델에 대한 개선을 제공합니다.

4T1 모델은 잘 확립되어 있으며, 대부분의 실험실은 2001년 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그가 설명한 프로토콜과 같은 프로토콜을 사용합니다. 4T1 세포주6-티오구아닌(6TG)은 내성 및 단계 IV, 삼중 음성 유방암3,4,5의대표이다. 그것은 정형 소 모델이며 인간 유방암3,4에서와같은 장기에 자발적으로 전이되기 때문에 임상적으로 관련이 있다. 4T1 세포는 주입된 세포의 양에 기초하여 예측 가능한 속도로 자발적으로 전이3,4. 중요한 것은, 여기에서 사용된 마우스 사이 유전다름은 전이성 부담에 있는 예상된 개별 간 가변성을 일으키는 원인이 되었습니다. 전이를 평가하기 위해, 조직은 6TG 선택 및 메틸렌 블루 스테인링을 사용하여 먼 부위의 암세포를 수집하고 정량화하기 위해 수확됩니다. 그 결과 전이성 식민지를 나타내는 파란색 점이 있는 조직 배양 판의 컬렉션이 생성됩니다. 그러나 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그 프로토콜은 이를 수동으로 계산하여 전이성 식민지를 정량화하므로 이 모델에서 전이를 평가하는 표준 수단이 되었습니다. 이것은 낮은 전이성 부담을 가진 조직에 대 한 쉬운, 폐 같은 조직은 종종 전이와 함께 라덴. 폐 판은 매우 수렴 될 수 있기 때문에 수동 계수로 전이성 식민지를 정확하고 정확하게 정량화하기가 어렵고 인간의 실수가 발생하기 쉽습니다. 전이성 부담을 더 잘 정량화하기 위해 피지-ImageJ를 사용하여 인간 카운팅 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 설명합니다. 혈종실린및 에오신(H&E) 염색을 통해 조직병리학적 분석은 폐 전이를 정량화하는 또 다른 수단이며, 흥미롭게도 피지-ImageJ 소프트웨어6,7로개선되었다. 그러나, 조직 병리학 적 분석은 폐의 단일 조각을 관찰하기 때문에, 그것은 부정확하고 대표적이지 않을 수 있습니다. 이는 4T1 모델이 고르게 분포되지 않는 장기 전체에 여러 전이성 병변을 일으키기 때문이다. 조직 병리학 적 분석과 수동 계수 사이의 전반적인 추세는 유사 할 수 있지만8,개별 값은 다를 수 있으므로 조직 병리학 분석은 정량화의 유일한 수단으로 사용되어서는 안됩니다. 우리는 조직 병리학 적 분석과 다른 카운터 사이의 수동 계산의 불일치에 비해 이점을 입증하면서 피지 -ImageJ를 사용하는 일관성을 보여줍니다. 또한, 우리는이 방법은 수동 계산에 의존 할 때보다 훨씬 빨리 자신의 연구에서 데이터를 분석 할 수 있다는 것을 의미 10-14 일에서 5 일로 잠복기 시간을 줄일 수 있음을 보여줍니다.

이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 프로토콜3에대한 간단한 조정 모음입니다. 4T1 모델은 널리 사용되고 폐 전이가 전임상 모델에서 측정하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 우리는 이 방법이 널리 사용될 수 있고 유방암 연구자에 매우 가치가 있다고 믿습니다. 필요한 유일한 추가 소모품은 카메라와 피지-ImageJ와 컴퓨터에 대 한 액세스, 이미지 분석에 자주 사용 하는 무료 소프트웨어9. 이 방법은 특히 폐 전이에 초점을 맞추고 있지만, 상당한 전이성 부담을 가진 다른 조직에 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 보건 가이드에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜을 수행하려면 적절한 기관의 허가와 모든 적절한 지침을 준수해야 합니다.

1. 세포 배양

  1. 완전한 문화 매체를 만듭니다 (RPMI + 10 % 태아 소 혈청 +1 % 펜 스트렙). ATCC프로토콜(10)에 따른 4T1 세포를 부활시키고 T-25 플라스크에서 37°C 및 5% CO2에서 컨서크까지 배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 부활 한 다음 날 미디어를 변경하고, 세포가 통과 할 만큼 혼잡하기 전에 미디어가 소비되는 경우 다시.
  2. 일단 T-25 플라스크가 컨실트되면, 세포를 T-75 플라스크로 파기하여 미디어를 폐기하고, 1x 덜벡코의 인산염 버퍼살린 살린(DPBS)의 5mL로 플라스크를 세척하고 트립신-EDTA의 500 μL을 추가한다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
    1. 분리되면 셀에 온난한 완전한 배양 배지 5mL을 추가합니다. 5mL을 15mL의 온난한 완전한 문화 매체를 포함하는 T-75 플라스크로 흡인및 전송한다.
  3. T-75 플라스크의 통로 세포는 적어도 네 번 플라스크합니다. 플라스크가 1x DPBS 8mL로 세척하고, 세포를 분리하기 위한 트립신-EDTA 1mL을 추가하고, 10mL의 온온 된 미디어를 세포에 추가하고, 1:6-1:8을 20mL의 완전한 배양 배지를 포함하는 새로운 T-75 플라스크에 희석하여 이 작업을 수행하십시오.
  4. 40mL의 온난한 완전한 배양 배지를 함유한 T-150 플라스크의 적절한 수까지의 통로 세포는 주입될 마우스의 수를 위한 것이다. 대부분의 연구는 주사를 위한 충분한 세포를 지키기 위하여 다중 T-150 플라스크를 요구할 것입니다.
  5. 마우스를 주입할 준비가 되면(IACUC 또는 기관 프로토콜에 따라 8주 이상 또는 20g 이상 계량), 미디어를 폐기하여 세포를 수확하고, 각 플라스크를 1x DPBS10mL로 세척하고 트립신-EDTA 2mL를 첨가한다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
  6. 완전한 매체10mL로 플라스크를 세척하고 모든 내용물(10mL의 미디어 + 트립신-EDTA 세포 혼합물2mL)을 다음 플라스크로 옮겨보세요. 과도한 양의 매체를 사용하지 않도록 동일한 10mL의 미디어를 사용하여 각 플라스크에서 세포를 세척하고 수집합니다.
    1. 모든 플라스크가 수집되면 내용물들을 50mL 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 마이크로센트심분리기 튜브에 계수하기 위한 10μL 샘플을 수집하고 50mL 원심형 튜브를 125 x g에서 5분간 원심분리합니다.
  7. 세포가 원심분리되는 동안, 세포 샘플의 10 μL에 Trypan 블루의 10 μL을 추가합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다. 총 세포 수가 결정되면 마우스당 1.2 x 106 세포(100 μL당)에 마우스를 주입하는 데 필요한 세포의 농도를 계산합니다.
  8. 원심분리 후, 데산스 미디어 및 100 μL당 1.2 x 106 셀에 대한 멸균 1x DPBS의 정확한 양으로 세포 펠릿을 재중단한다. 세포/DPBS 혼합물을 마이크로원심분리기 튜브로 분할하여 주사를 위해 세포를 흡입할 때 주사기에 쉽게 접근할 수 있습니다. 얼음에 세포를 유지하고 세포가 오랜 시간 동안 얼음에있는 후 죽기 시작으로 곧 주입.

2. 주사

  1. 마이크로센트심분리기 튜브를 두드리거나 부드럽게 혼합하여 세포를 재일시 중단한 다음 600 μL을 1mL 주사기로 흡인하여 주입을 위한 세포를 준비합니다. 주사기를 위쪽으로 돌리고 플런저를 아래로 당겨 주사기 개구부에서 세포를 멀리 가져옵니다. 주사기를 눌러 기포를 제거합니다.
  2. 바늘 을 부착하고 500 μL만 주사기에 남아있을 때까지 마이크로 원심 분리기 튜브에 세포를 다시 분배합니다. 얼음에 주사기를 평평하게 놓습니다.
    참고: 4T1 셀은 서스펜션에서 빠르게 떨어집니다. 따라서 세포를 자주 탭하여 세포를 현탁액으로 다시 혼합하는 것이 중요합니다.
  3. 이소플루란 또는 기타 승인된 마취제를 사용하여 8주 된/>20g 암컷 BALB/c 마우스를 마취합니다. 마우스의 호흡을 모니터링하여 마취의 깊이를 평가합니다.
  4. 마우스가 각막 반사의 부족으로 표시된 대로 제대로 마취되면 마우스를 뒷면에 놓습니다. 엄지 손가락, 포인터 및 가운데 손가락을 사용하여 마우스를 부드럽게 누릅니다. 포인터와 가운데 손가락을 사용하여 마우스의 상반신과 왼쪽 다리의 엄지 손가락을 잡습니다. 부드럽지만 확고합니다.
  5. 바늘의 배꼽을 위로, 마우스의 왼쪽 복부 유방 지방 패드에 피하로 세포의 100 μL을 주입. 좋은 흠과 누출을 모니터링하고 마우스가 깨어나서 주입 후 쉽게 움직일 수 있도록 하십시오.
    1. 각 마우스 사이에 바늘을 변경합니다.
      참고: 바늘이 복막 구멍에 들어가는 것을 허용하지 마십시오. 이것은 암이 빨리 퍼지고 모형의 대표적이지 않기 위하여 일으키는 원인이 될 것입니다. 피하 주사를 보장하기 위해 왼쪽 복부 유방 지방 패드에 삽입 할 때 바늘위로 부드럽게 당깁니다. 바늘이 쉽게 위쪽으로 들어 올리면 피하위치로 올바르게 배치됩니다.

3. 모니터링

  1. 체중, 신체 상태 점수, 종양 크기, 종양 상태, 호흡, 활동 수준, 외관 및 움직임을 위해 일주일에 3회 이상 마우스를 모니터링합니다. 종양이 직경 0.7-0.8cm에 도달하면 매일 모니터링하기 시작합니다.
    1. 종양 크기가 1.5cm에 도달하면 안락사를 고려하거나 체중 감소가 20%에 도달하거나 신체 상태 점수, 종양 상태, 호흡, 활동 수준, 외관 또는 움직임이 제도적 지침에 따라 관찰됩니다.
      참고: 종양의 크기가 증가함에 따라 체중이 증가할 수 있기 때문에 신체 상태 점수가 모니터링하는 것이 중요합니다. 정확한 모니터링 프로토콜은 승인된 IACUC 또는 기관 프로토콜에 따라 달라집니다.

4. 네크로키

  1. 기관 지침에 따라 CO2를 사용하여 마우스를 안락사시합니다.
  2. 소독하기 위해 70%의 에탄올로 마우스를 스프레이하세요. 신체 구멍을 노출 마우스의 복부 중간선을 절개합니다.
  3. 신장을 제거합니다. 다이어프램이 보일 때까지 중간선을 계속 절단합니다. 가위를 사용하여 다이어프램에 구멍을 뚫어 폐를 수축시하십시오. 다이어프램을 트리밍하여 캐비티에 더 잘 접근할 수 있습니다.
  4. 무딘 가위를 사용하여 흉곽의 중심을 잘라냅니다. 폐와 심장을 드러내기 위해 다시 고정 흉곽.
  5. 신장이 제거된 복강에서 풀링될 때까지 심장 정점에 바늘을 삽입하여 2mL의 비멸 균 1x DPBS로 심장을 퍼퓨즈합니다.
  6. 심장과 폐를 제거하려면 무딘 가위를 사용하여 식도와 기관지를 심장 바로 위에 자른다. 집게를 사용하여, 몸에서 멀리 심장을 당기고 부착 유지 어떤 결합 조직에서 잘라 시작합니다. 폐는 심장과 함께 나올 것입니다.
  7. 멀티 로브(오른쪽)와 단일 로브(왼쪽) 폐를 식별합니다. 참조를 위해 부착 된 심장을 유지하지만 폐가 확인되면 심장을 잘라냅니다.
  8. 각 우물에 행크의 균형 잡힌 식염수 솔루션(HBSS)이 포함된 12개의 웰 플레이트에 라벨을 부착합니다. 각 마우스는 2 개의 우물이 필요합니다. 전이 평가를 위해 12 개의 우물 판에 멀티 로브 (오른쪽) 폐를 놓고 얼음을 유지하십시오. 지금은 이웃을 잘 비워 두십시오.
    참고: 각 샘플의 크기가 가깝도록 모든 마우스에서 동일한 폐(멀티 로브)를 사용하는 것이 중요합니다. 단 하나 로브 폐는 그 때 조직 병리학 같이 그밖 분석을 위해 이용될 수 있습니다.
    참고: 샘플은 몇 시간 동안 얼음이나 4°C에서 안정적입니다.

5. 조직 처리

참고: 이 섹션의 모든 단계는 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

  1. 마우스 당 1 15mL 원전 튜브를 라벨과 각 튜브에 2.5mL 타입 IV 콜라게나아제 혼합물과 30 단위의 엘라스타아제를 추가합니다. 타입 IV 콜라게나아제 혼합물을 만들기 위하여는, mL 1x HBSS 및 멸균 필터 당 타입 IV 콜라게나아제의 2 mg을 녹입니다. 이는 -20°C에서 최대 12개월까지 보관하고 필요할 때 해동할 수 있다.
  2. 폐를 두 번째로 옮기고, 그 견본을 위해 잘 1x HBSS를 청소합니다. 남은 혈액을 제거하기 위해 집게를 사용하여 소용돌이. 깨끗한 폐를 빈 3.5 cm 조직 배양 판으로 옮기습니다. 가위로 폐를 다진다. 1x HBSS2.5mL의 린스 플레이트는 1x HBSS와 폐 조각을 이미 콜라게나아제/엘라스타제 칵테일(총 5mL)을 함유하고 있는 15mL 원전 튜브로 옮킨다.
  3. 4 °C에서 75 분 동안 배양하십시오. 이 시간 동안 샘플을 계속 혼합하므로 튜브를 로커 또는 회전 휠에 배치하십시오. 이 인큐베이션 단계 동안 각 마우스에 대해 50mL 원심분리기 튜브와 10cm 조직 배양 판을 라벨로 지정합니다. 희석을 하는 경우 희석을 위해 충분한 10cm 조직 배양 판을 라벨로 지정하십시오.
    참고: 조직 배양 판의 뚜껑에 라벨을 붙입니다. 접시 자체에 레이블을 지정하는 경우, 쓰기피지-ImageJ 분석을 방해할 것입니다.
  4. 1배 HBSS로 각 튜브의 최대 10mL 를 가져옵니다. 각 샘플에 대해 70 μm 셀 스트레이너위에 내용물을 50mL 원문 튜브에 붓습니다. 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 갈아서 더 많은 세포가 걸러낼 수 있도록 합니다.
  5. 원심 분리기는 실온 (RT)에서 350 x g에서 5 분 동안. 1x HBSS10mL로 상체를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다.
  6. RPMI 또는 IMDM 중 60 μM 6TG 완전 문화 매체의 10mL에서 펠릿을 재중단합니다. 10cm 세포 배양 판에서 플레이트 샘플을, 원하는 경우 희석 방식을 사용하여. 37°C에서 배양하고 5일 동안 5%CO2를 배양합니다.
    참고: 1:2, 1:10 및 1:100은 연구 매개 변수에 따라 경험적으로 결정되어야 하는 일반적인 희석제입니다.
    주의: 6TG는 독성이 있습니다. 취급 시 주의하고 폐기를 위한 모든 환경 보건 및 안전 지침을 따르십시오.

6. 스테인딩 플레이트

  1. 적절한 폐기물 용기에 접시를 배양 미디어를 부어. 플레이트당 5mL의 희석되지 않은 메탄올을 추가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 전체 플레이트를 덮도록 메탄올을 소용돌이치게 합니다.
    주의: 메탄올은 섭취, 흡입 또는 피부에 있는 경우 위험합니다. 이 단계에 는 연기 후드를 사용합니다.
  2. 메탄올을 접시에 붓고 적절한 폐기물 용기에 넣습니다. 접시당 증류수 5mL로 접시를 헹구고 적절한 폐기물 용기에 물을 붓습니다. 플레이트당 0.03% 메틸렌 블루 5mL를 추가하고 RT에서 5분 동안 배양하여 메틸렌 블루 용액을 소용돌이시켜 전체 플레이트를 덮습니다.
  3. 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 접시 당 증류수 5mL로 다시 접시를 헹구십시오. 접시를 거꾸로 뒤집어 종이 타월에 얼룩을 두어 여분의 액체를 제거합니다. 뚜껑에 접시를 놓고 RT에서 밤새 공기를 건조시키십시오.
    참고: 전이성 식민지는 파란색이 될 것입니다. 플레이트가 건조되면 RT에 무기한 보관할 수 있습니다.

7. 이미지 분석

  1. 샘플의 명확한 식별을 보장하기 위해 주의, 접시에서 라벨 뚜껑을 제거합니다. 모든 스테인드 폐 판을 깨끗하고 밝은 표면에 정렬하여 모든 플레이트를 하나의 이미지로 촬영합니다.
  2. 조명이 잘 되는 공간에서 플레이트 컬렉션을 촬영하여 플레이트가 매우 반사되어 반사를 최소화합니다. 플레이트의 반사는 이미지 분석에 영향을 미치므로 피해야 합니다.
    참고 : 피지 - 이미지J의 상한이 2 기가 픽셀. 대부분의 현대 스마트 폰은 충분한 카메라를 해야합니다. 8메가픽셀 미만의 카메라를 사용하지 마십시오. 이 실험에 사용된 카메라는 Google 픽셀 2에서 12.2 메가 픽셀이었습니다.
  3. 플레이트를 포함하도록 이미지를 자르지만 이미지 배경에 있는 뚜껑이나 다른 것은 제외합니다. 피지 이미지J에 잘려진 이미지를 업로드합니다.
  4. 이미지, 조정, 색상 임계값, 임계값 임계값, 임계값 설정 방법: 기본값, 임계값 색상: B&W, 임계값 공간: Lab. 어두운 배경 상자 선택 취소: 다음 명령을 사용하여 이미지를 흑백으로 변경합니다. 이제 이미지가 흑백이어야 합니다. 검은색은 밝은 배경을 나타내고 흰색은 파란색 전이성 콜로니를 나타냅니다.
  5. 피지-ImageJ 도구 모음의 원 도구를 사용하여 분석할 영역을 선택합니다. 각 플레이트가 동일한 크기의 영역에 대해 분석되도록 모든 플레이트에 사용할 원 1개를 그립니다. 플레이트 가장자리에 나타나는 배경 잡음을 최소화하면서 플레이트의 분석 영역을 최대화하는 크기를 선택합니다. 크기는 그릴 때 도구 모음에 나타나므로 원이 그려질 때 높이와 너비를 모니터링하여 완벽한 원을 만들 수 있습니다.
  6. 선택한 원을 분석하여 파란색 전이성 콜로니가 있는 플레이트 영역을 나타내는 영역의 백분율이 흰색인지 확인합니다. 다음 명령을 사용합니다.
    분석, 분석 입자, 크기 (픽셀2):0-무한대, 원형: 0.00-1.00, 표시: 없음, 및 요약 상자를 확인 합니다. 확인을 명중.
  7. % 영역 결과를 기록합니다. 이는 선택한 영역의 백분율이며 따라서 전이성 부담을 나타냅니다.
    참고: 결과를 피지-ImageJ에 저장하거나 전체 결과 페이지를 별도의 문서에 복사/붙여넣는 것이 좋습니다. % 영역 결과가 예기치 않거나 의심스러운 경우 다른 측정값도 의심스러운지 또는 % 영역이 잘못 기록되었는지 확인할 수 있습니다.
  8. 그 크기를 중앙에 잡아서 크기를 변경하지 않고 원을 그림의 다음 접시로 이동합니다. 그림의 모든 플레이트에 대해 7.6 및 7.7 단계를 반복합니다.
  9. 7.1 - 7.8 단계를 두 개 이상의 이미지에서 반복합니다. 모든 플레이트와 이미지를 분석한 결과 각 플레이트의 서로 다른 이미지 간에 평균 %면적 결과가 생성되어 그림 간의 불일치를 완화합니다.

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결과

이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 4T1 프로토콜3에서 간단한 조정을 포함하고 그림 1에서시각화할 수 있다. 3명의 별도 연구원이 12개의 폐판(1:10 희석)에 대해 수동으로 전이성 콜로니를 계산했을 때, 결과는 다른카운터(그림 2A)간에매우 일치하지 않았다. 모든 연구자들은 "푸른 점으로 나타나는 전이성 식민지를 계산"하도록 지시받았지만, 불일치는 고전이성 플레이트를 수동으로 계산하는 문제를 보여줍니다. 연구원은 4T1 모형을 가진 경험의 다양한 수준을 가졌습니다. 보드 인증 수의병리학자는 피지-ImageJ 폐판분석(도 2B)과비교하기 위한 또 다른 방법으로 전이를 위한 H&E 염색폐 슬라이드를 분석하였다.

피지-ImageJ 분석을 사용하여 3명의 별도 연구원...

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토론

입증된 바와 같이, 각 폐 판상에 전이성 콜로니를 수동으로 세는 것은 폐 전이를 정량화하는 부정확하고 부정확한 방법이 될 수 있으며, 더 나은 정량화 수단에 대한 필요성을 입증할 수있다(도 2). 히스토병학적 분석은 H&E 슬라이드가 전체 장기의 대표적인 샘플이 아니기 때문에 수동 계수와 피지-ImageJ분석(그림 2B 및 4D)과약간 차이가 있었습니다. 프로토콜은 전체 폐를 수확하고, 그러므로 총 폐 전이를 더 대표하고, 수동 계산 보다는 더 일관적입니다. 피지-ImageJ 분석에 대 한 몇 가지 다른 접근 시도 하 고 아래 설명, 하지만 위에서 설명 하는 프로토콜 우수한 방법으로 나타납니다.

폐, 혈액 및 뇌 샘플이 연구를 위해 수집되었습니다. 그러나, 혈액과 두뇌 견본은 아주 몇몇 전이성 식민지가 있었습니다, 전혀 있는 경우에. 우리는 수...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 버지니아 -메릴랜드 수의과 대학 (IA), 엔지니어링 건강을위한 중요한 기술 및 응용 과학 센터 (IA), 및 건강 R21EB028429 (IA)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anesthesia chamber댓글 보기댓글 보기 댓글 보기기관 정책에서 승인된 자료 사용
마취제댓글 보기댓글 보기 댓글 보기기관 정책에서 승인된 자료 사용
BALB/c 암컷 마우스잭슨 연구소000651
무딘 가위RobozRS-6700
계산기모든카메라
모든8 메가 픽셀
원심 분리기모든125 x g 및 300 x g
CO2 설정이의견 보기의견 보기기관의 정책에서 승인된 자료 사용
냉장실, 냉장고, 냉장 창고모든것
Fiji-ImageJ가 있는 컴퓨터AnyAny Fiji-ImageJ
Counting ChamberFisher Scientific02-671-10
곡선 가위RobozRS-5859
증류수AnyAny
ElastaseMP Biomedicals100617
전자 저울AnyAny
소 태아 세럼 (FBS)R& D SystemsS11150
펜치RobozRS-8100
아이스N/AN/A
인큐베이터코멘트보기 댓글 보기5% CO2 및 37 ° C
메탄올피셔 사이언티픽A412SK-4
메틸렌 블루시그마-알드리치03978-250ML
페니실린 스트렙토마이신ATCC30-2300
핀 또는 바늘부검 중 마우스를 고정하기 위한모든
플라스틱 캘리퍼스VWR25729-670
RMPI-1640 매체ATCC30-2001
로커 또는 회전 휠날카로운
가위RobozRS-6702
PES 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터ThermoFisher Scientific568-0010
T-150 플라스크Fisher Scientific08-772-48
T-25 플라스크Fisher Scientific10-126-10
T-75 플라스크Fisher Scientific13-680-65
삼각 플라스틱 비커Fisher Scientific14-955-111F생쥐의 무게를 측정하는 데 사용
Trypan blueVWR97063-702
Trypsin-EDTAATCC30-2101
Type IV collagenaseSigma-AldrichC5138
3.5cm 조직 배양 플레이트Nunclon153066
1 mL 주사기BD309659
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브VWR87003-294
10 cm 조직 배양 플레이트Fisher Scientific08-772-22
12 웰 플레이트Corning3512
15 mL 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-959-70C
1X 둘베코의 포스페이트 완충 식염수(DPBS)피셔 사이언티픽SH30028FS
1X 행크' s 균형 식염수 (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 in 바늘Fisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&샤이; 2539&무역;)ATCCCRL-2539
50 mL 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-959-49A
6-티오구아닌시그마-알드리치A4882
70 μ M 세포 여과기Fisher Scientific22-363-548
70% 에탄올Sigma AldrichE7023DI 물로 70%로 희석
최소 가능해야 함

참고문헌

  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).
  3. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).
  4. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research. 58 (7), 1486-1493 (1998).
  5. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  6. Sikpa, D., et al. Automated detection and quantification of breast cancer brain metastases in an animal model using democratized machine learning tools. Scientific Reports. 9 (1), 17333(2019).
  7. Valkonen, M., et al. Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests. Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).
  8. Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. ATCC. A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet. ATCC. , (2020).

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