Method Article

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

DOI:

10.3791/61805

⸱

October 2nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 피지-ImageJ를 사용하여 4T1 유방암 모델에서 폐 전이를 정량화하는 보다 일관되고 신속한 방법을 설명합니다.

Abstract

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유방암은 2019년에만 미국에서 40,000명의 여성 사망과 30%의 새로운 여성 암 진단을 차지하는 파괴적인 악성 종양입니다. 유방암 관련 죽음의 주요 원인은 전이성 부담입니다. 따라서 유방암을 위한 전임상 모델은 전이성 부담을 임상적으로 관련시키기 위해 분석할 필요가 있다. 4T1 유방암 모델은 단계 IV 인간 유방암을 위한 자발적으로 전이되고 정량화 가능한 마우스 모델을 제공합니다. 그러나, 대부분의 4T1 프로토콜은 조직 배양 판에 스테인드 콜로니를 수동으로 계수함으로써 전이성 부담을 정량화한다. 이는 전이성 부담이 낮은 조직에 충분하지만 수동 계산의 인간의 오류는 플레이트가 혼잡하고 계산하기 어려운 경우 일관성이 없고 가변적인 결과를 초래합니다. 이 방법은 인간 계수 오류에 대한 컴퓨터 기반 솔루션을 제공합니다. 여기서, 우리는 4T1 모델에서 고전이성 조직인 폐를 이용한 프로토콜을 평가한다. 피지-ImageJ에서 분석을 위해 메틸렌 블루 스테인드 플레이트의 이미지를 획득하여 업로드합니다. 피지-ImageJ는 전이성 부담이 있는 플레이트의 백분율을 나타내는 파란색 이미지의 선택된 영역의 백분율을 결정합니다. 이 컴퓨터 기반 접근 방식은 고전이성 조직에 대한 수동 계수 또는 조직 병리학 평가보다 더 일관되고 신속한 결과를 제공합니다. 피지-ImageJ 결과의 일관성은 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이미지 간의 결과에 약간의 변화가 발생할 수 있으므로 여러 이미지를 촬영하고 결과를 평균화하는 것이 좋습니다. 최소한의 한계에도 불구하고,이 방법은 일관되고 신속한 결과를 제공함으로써 폐의 전이성 부담을 정량화하는 개선입니다.

Introduction

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8명의 여자에 대하여 1개는 그녀의 일생에 있는 유방암으로 진단될 것입니다, 그러나 다중 처리 선택권에도 불구하고 유방암은 미국 여자에 있는 암 관련 죽음의 두 번째 주요한 원인입니다 1. 이 여자는 그들의 유방에 있는 1 차적인 종양에서 정지하지 않습니다. 대신, 전이성 부담은 일반적으로 폐, 뼈, 두뇌, 간 및 림프절2로퍼지기 때문에 이 질병의 사망에 책임 있습니다. 이 때문에 유방암 모델은 이 질병의 사망률을 억제하는 데 기여하기 위해 전이를 평가해야합니다. 4T1 뮤린 유방암 모델은 이를 달성하기 위한 훌륭한 프로토콜입니다. 여기에 설명된 방법은 피지-ImageJ를 사용하여 폐 전이를 정량화하여 일관되고 신속한 결과를 생성함으로써 4T1 모델에 대한 개선을 제공합니다.

4T1 모델은 잘 확립되어 있으며, 대부분의 실험실은 2001년 풀라스키와 오스트랜드-로젠버그가 설명한 프로토콜과 같은 프로토콜을 사용합니다. 4T1 세포주6-티오구아닌(6TG)은 내성 및 단계 IV, 삼중 음성 유방암3,4,

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Protocol

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여기에 설명된 모든 방법은 버지니아 공대의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 보건 가이드에 따라 승인되었습니다. 이 프로토콜을 수행하려면 적절한 기관의 허가와 모든 적절한 지침을 준수해야 합니다.

1. 세포 배양

  1. 완전한 문화 매체를 만듭니다 (RPMI + 10 % 태아 소 혈청 +1 % 펜 스트렙). ATCC프로토콜(10)에 따른 4T1 세포를 부활시키고 T-25 플라스크에서 37°C 및 5% CO2에서 컨서크까지 배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 부활 한 다음 날 미디어를 변경하고, 세포가 통과 할 만큼 혼잡하기 전에 미디어가 소비되는 경우 다시.
  2. 일단 T-25 플라스크가 컨실트되면, 세포를 T-75 플라스크로 파기하여 미디어를 폐기하고, 1x 덜벡코의 인산염 버퍼살린 살린(DPBS)의 5mL로 플라스크를 세척하고 트립신-EDTA의 500 μL을 추가한다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
    1. 분리되면 셀에 온난한 완전한 배양 배지 5mL을 추가합니다. 5mL을 15mL의 온난한 완전한 문화 매체를 포함하는 T-75 플라스크로 흡인....

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Results

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이 방법은 풀라스키 및 오스트랜드-로젠버그 4T1 프로토콜3에서 간단한 조정을 포함하고 그림 1에서시각화할 수 있다. 3명의 별도 연구원이 12개의 폐판(1:10 희석)에 대해 수동으로 전이성 콜로니를 계산했을 때, 결과는 다른카운터(그림 2A)간에매우 일치하지 않았다. 모든 연구자들은 "푸른 점으로 나타나는 전이성 식민지를 계산"하도록 지시받았지만, 불일치는 고전이성 플레이트를 수동으로 계산하는 문제를 보여줍니다. 연구원은 4T1 모형을 가진 경험의 다양한 수준을 가졌습니다. 보드 인증 수의병리학자는 피지-ImageJ 폐판분석(도 2B)과비교하기 위한 또 다른 방법으로 전이를 위한 H&E 염색폐 슬라이드를 분석하였다.

피지-ImageJ 분석을 사용하여 3명의 별도 연구원.......

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Discussion

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입증된 바와 같이, 각 폐 판상에 전이성 콜로니를 수동으로 세는 것은 폐 전이를 정량화하는 부정확하고 부정확한 방법이 될 수 있으며, 더 나은 정량화 수단에 대한 필요성을 입증할 수있다(도 2). 히스토병학적 분석은 H&E 슬라이드가 전체 장기의 대표적인 샘플이 아니기 때문에 수동 계수와 피지-ImageJ분석(그림 2B 및 4D)과약간 차이가 있었습니다. 프로토콜은 전체 폐를 수확하고, 그러므로 총 폐 전이를 더 대표하고, 수동 계산 보다는 더 일관적입니다. 피지-ImageJ 분석에 대 한 몇 가지 다른 접근 시도 하 고 아래 설명, 하지만 위에서 설명 하는 프로토콜 우수한 방법으로 나타납니다.

폐, 혈액 및 뇌 샘플이 연구를 위해 수집되었습니다. 그러나, 혈액과 두뇌 견본은 아주 몇몇 전이성 식민지가 있었습니다, 전혀 있는 경우에. 우리는 수.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 버지니아 -메릴랜드 수의과 대학 (IA), 엔지니어링 건강을위한 중요한 기술 및 응용 과학 센터 (IA), 및 건강 R21EB028429 (IA)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia chamber댓글 보기댓글 보기 댓글 보기기관 정책에서 승인된 자료 사용
마취제댓글 보기댓글 보기 댓글 보기기관 정책에서 승인된 자료 사용
BALB/c 암컷 마우스잭슨 연구소000651
무딘 가위RobozRS-6700
계산기모든카메라
모든8 메가 픽셀
원심 분리기모든125 x g 및 300 x g
CO2 설정이의견 보기의견 보기기관의 정책에서 승인된 자료 사용
냉장실, 냉장고, 냉장 창고모든것
Fiji-ImageJ가 있는 컴퓨터AnyAny Fiji-ImageJ
Counting ChamberFisher Scientific02-671-10
곡선 가위RobozRS-5859
증류수AnyAny
ElastaseMP Biomedicals100617
전자 저울AnyAny
소 태아 세럼 (FBS)R& D SystemsS11150
펜치RobozRS-8100
아이스N/AN/A
인큐베이터코멘트보기 댓글 보기5% CO2 및 37 ° C
메탄올피셔 사이언티픽A412SK-4
메틸렌 블루시그마-알드리치03978-250ML
페니실린 스트렙토마이신ATCC30-2300
핀 또는 바늘부검 중 마우스를 고정하기 위한모든
플라스틱 캘리퍼스VWR25729-670
RMPI-1640 매체ATCC30-2001
로커 또는 회전 휠날카로운
가위RobozRS-6702
PES 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터ThermoFisher Scientific568-0010
T-150 플라스크Fisher Scientific08-772-48
T-25 플라스크Fisher Scientific10-126-10
T-75 플라스크Fisher Scientific13-680-65
삼각 플라스틱 비커Fisher Scientific14-955-111F생쥐의 무게를 측정하는 데 사용
Trypan blueVWR97063-702
Trypsin-EDTAATCC30-2101
Type IV collagenaseSigma-AldrichC5138
3.5cm 조직 배양 플레이트Nunclon153066
1 mL 주사기BD309659
1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브VWR87003-294
10 cm 조직 배양 플레이트Fisher Scientific08-772-22
12 웰 플레이트Corning3512
15 mL 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-959-70C
1X 둘베코의 포스페이트 완충 식염수(DPBS)피셔 사이언티픽SH30028FS
1X 행크' s 균형 식염수 (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 in 바늘Fisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&샤이; 2539&무역;)ATCCCRL-2539
50 mL 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-959-49A
6-티오구아닌시그마-알드리치A4882
70 μ M 세포 여과기Fisher Scientific22-363-548
70% 에탄올Sigma AldrichE7023DI 물로 70%로 희석
최소 가능해야 함

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (201....

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