마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

Mingxiao Feng; Sara Divall; Sheng Wu

doi:10.3791/61812

Method Article

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

DOI:

10.3791/61812

⸱

October 25th, 2021

Mingxiao Feng¹ , Sara Divall³ , Sheng Wu¹^,²

¹Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Physiology, Temple University School of Medicine, ³Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원발성 간세포는 시험관내 간 연구, 특히 포도당 대사 연구에서 광범위하게 사용된다. 기본 기술은 시간, 노동, 비용 및 원발성 간세포 사용과 같은 다양한 요구에 따라 적용되어 다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜을 초래합니다. 그러나, 원발성 간세포 단리에서의 수많은 단계 및 시간 소모적인 시약 제제는 효율성을 위한 주요한 단점이다. 장단점에 대해 서로 다른 프로토콜을 비교 한 후 각각의 장점을 결합하고 신속하고 효율적인 원발성 간세포 분리 프로토콜을 공식화했습니다. 불과 ~ 35 분 이내에이 프로토콜은 다른 프로토콜만큼 건강한 원발성 간세포를 산출 할 수 있습니다. 또한, 분리된 원발성 간세포를 사용하여 수행된 글루코스 대사 실험은 시험관내 간 대사 연구에서 이러한 프로토콜의 유용성을 검증하였다. 우리는 또한이 연구의 각 단계의 중요성과 목적을 광범위하게 검토하고 분석하여 미래의 연구자가 필요에 따라이 프로토콜을 더욱 최적화 할 수 있도록했습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간은 음식 소화, 혈액 순환 및 해독과 같은 수많은 생명 유지 기능에서 중요한 역할을하기 때문에 척추 동물의 신체에서 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 시험관내 배양에서 마우스 원발성 간세포의 사용은 탄수화물 대사 및 간 암종에 대한 연구에서 점점 더 대중화되고 있다. 따라서, 마우스의 선천적 생리적 기능을 유지하면서 원발성 간세포를 분리하기 위한 편리한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 포도당 대사의 허브로서의 기능으로 인해 간은 포도당 생산 및 저장의 중심이기도합니다¹. 시험관 내에서 원발성 간세포를 이용한 실험은 대부분의 포도당 대사 연구에 필수적이다. 따라서 수년 동안 다양한 연구 그룹이 마우스 원발성 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다.

마우스 간세포 분리의 일반적인 절차는 먼저 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)과 같은 이소형 액체로 간에서 혈액을 씻어 낸 다음 콜라게나제 함유 용액을 사용하여 간세포를 해리시키는 것입니다. 이러한 프로토콜은 일반적인 절차를 공유하지만 필요에 따라 시약과 단계가 다릅니다. 그러나 필요한 시약을 준비하고 분리 단계를 수행하는 데는 시간이 걸립니다. 본 프로토콜을 개발할 때, 효율성은 우선 ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스(8주령)를 본 연구에 사용하였다.

1. 준비:

윌리엄의 E 배지 (GlutaMAX 보충제)를 10 % FBS 및 1 % 항생제 - 항균제 용액과 혼합하여 배양 배지를 만듭니다.
25 mL의 콜라게나제-디스파제 배지 (예를 들어, 간 소화 배지)를 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 입자 파편을 제거하였다.
50 mL의 이중 증류 H2O (_ddH2O), 35 mL의 관류 배지 (예를 들어, 간 관류 배지) (또는 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 50 mL), 및 25 mL의 여과된 콜라게나제-디스파제 배지를 45°C 수조에서 30분 동안 가온하였다.
멸균 조직 배양 후드 내에서 50mL 튜브에 10x HBSS 2mL와 Percoll 18mL를 섞어 20mL의 1x Percoll-HBSS를 만들고 얼음 또는 4°C에 보관합니다.
참고: 1x Percoll-HBSS는 최소 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
멸균 조직 배양 후드 내에, 30 mL의 세척 배지 (예를 들어, ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효율을 시험하기 위하여, 본원의 일차 간세포 분리 프로토콜이 8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행되었다. 분리된 원발성 간세포의 부착 및 순도를 시험하였다. 원발성 간세포 분리는 간 약물 효과 및 글루코스 대사, 제약 바이오마커 활성², 인슐린 감수성 및 글루코스 생산과 같은 간 생리학에 대한 매우 다양한 실험에 사용된다. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 원발성 간세포의 활성을 다음의 실험에서 시험하였다.

코팅은 본 프로토콜에서 원발성 간세포 부착을 위해 요구되지 않았다.
단리된 일차 간세포를 6-웰 플레이트 상에 5 x 10⁵ 세포/웰로 플레이팅하였다. 1시간 후, 확고한 부착이 관찰되었고, 1차 간세포는 도금 후 12시간 후에 완전히 팽창되었다(도 3). 이것은 도금 후 12 시간, 세포가 실험에 활용 될 준비가되었음을.......

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Discussion

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다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜이 개발되었다. 또한 다양한 요구에 따라 최적화되고 조정되었습니다 (표 1). 분리 프로토콜은 일반적으로 관류 (효소 소화 포함)와 정제의 두 부분으로 구성됩니다.

관류는 생체내 전체 간(2,20,21,22,23) 또는 해부된 간엽⁽²⁴)과 함께 수행될 수 있다. 해부된 엽의 관류는 일반적으로 기술적 용이성을 위해 좌측 및 중간 엽으로 제한되었다. 이론적으로, 생체 내 관류는 모든 엽과 함께 전체 간을 사용하기 때문에 더 많은 원발성 간세포를 산출해야합니.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 보건원 (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)의 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12웰 플레이트	FALCON	353043	코팅 불필요
6웰 플레이트	FALCON	353046	코팅 불필요
항-AKT	세포 신호	2920S
항생제 항진균 용액(100x), 안정화	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 &마이크로; m	CELLTREAT	229483
폐쇄형 IV 카테터, 24 게이지 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, 포도당 없음, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom 포도당 분석 키트	BioAssay 시스템	EBGL-100
소 태아 혈청 (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
글루카곤	Sigma-Aldrich	G2044
염소 안티 마우스 IgG 2차 항체	LI-COR	926-68070
염소 안티 토끼 IgG 2차 항체	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad 소프트웨어	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	세포 신호	13630S
인슐린	릴리	NDC 0002-8215-01
케타민 HCL (100 mg/mL)	호스피라 Inc	NDC 0409-2051-05
L-글루타민	Gibco	25030081
간 소화 매체	Gibco	17703-034	조직 배양 후드 내에서 50 mL 튜브에서 각각 25 mL로 분취하고 -20 °로 유지합니다. C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
연동 펌프	Gilson	Minipuls 2	4 mL/min으로 펌핑 가능
페트리 접시	Fisherbrand	08-757-12
냉장 원심분리기	Sorvall	Legend RT	4°C에서 50mL 튜브를 원심분리 가능; C
나트륨 L-젖산	시그마-알드리치	L7022
나트륨 피루브산	Gibco	11360070
주사기 필터, PVDF 0.45 &마이크로; m 직경 30mm	CELLTREAT	229745
주사기, 0.5mL	Becton Dickinson	329461
주사기, 60mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
관, 15mL	Corning	430052
, 50mL	Corning	430290
물 목욕 탱크	Corning	CLS6783	또는 최대 45°C까지 가열할 수 있는 모든 수조 탱크; C
윌리엄 s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10

전달 관

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
Severgnini, M., et al.

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