Xenopus 난모세포에서 인간 냄새에 대한 Aedes aegypti 냄새 수용체의 이종 발현 및 기능 분석

요약

2전극 전압 클램프와 결합된 Xenopus 난모세포 발현 시스템을 사용하여 사람의 냄새에 반응하는 모기 OR을 기능적으로 특성화하는 프로토콜이 제시되어 인간의 냄새에 대한 노출에 대한 모기 OR의 반응을 탐구하기 위한 강력한 새로운 기술을 제공합니다.

초록

황열병, 뎅기열, 지카열을 포함한 많은 중요한 인간 질병의 매개체인 모기 Aedes aegypti (Linnaeus)는 혈액 식사에 대해 다른 온혈 동물보다 인간 숙주에 대한 강한 선호도를 보여줍니다. 후각 신호는 모기가 주변 환경을 탐색하고 혈액 식사를 얻기 위해 인간 숙주를 찾아 인간 질병을 전염시킬 때 중요한 역할을 합니다. 후각 감각 뉴런에서 발현되는 냄새 수용체(OR)는 모기 매개체와 인간의 냄새의 상호 작용을 담당하는 것으로 알려져 있습니다. Ae. aegypti의 후각 생리학에 대한 더 깊은 통찰력을 얻고 분자 수준에서 인간과의 상호 작용을 조사하기 위해 우리는 Xenopus Oocytes 이종 발현의 최적화된 프로토콜을 사용하여 인간의 냄새에 반응하는 Ae. aegypti 냄새 수용체를 기능적으로 분석했습니다. 세 가지 예시 실험이 제시됩니다 : 1) 4 일에서 6 일 된 Ae. aegypti 더듬이의 OR과 냄새 수용체 공동 수용체 (Orco)의 cRNA 클로닝 및 합성; 2) Xenopus 난모세포에서 ORs 및 Orco의 미세주입 및 발현; 3) 2전극 전압 클램프로 mosquito ORs/Orco를 발현하는 Xenopus 난모세포의 전체 세포 전류 기록. 이러한 최적화된 절차는 연구자들이 흰줄숲모 기에서 인간의 냄새 수신을 조사하고 분자 수준에서 숙주 탐색 활동을 제어하는 기본 메커니즘을 밝힐 수 있는 새로운 방법을 제공합니다.

서론

황열병 모기인 Ae. aegypti는 황열병, 뎅기열, 지카열을 비롯한 많은 치명적인 질병을 전염시켜 엄청난 고통과 인명 손실을 초래할 수 있습니다. 모기는 숙주를 찾기 위해 CO₂, 피부 냄새, 체온과 같은 여러 신호를 사용합니다¹. 인간과 다른 온혈 동물 모두 CO₂를 생성하고 체온이 비슷하다는 점을 감안할 때, 암컷 Ae. aegypti는 숙주 구별²을 위해 주로 피부 냄새에 의존하는 것으로 보입니다. 그러나 이는 인간의 피부 발산물에서 300개 이상의 화합물을 분리한 초기 연구와 함께 복잡한 상황을 만들어냅니다³. 추가 행동 분석은 이러한 화합물 중 다수가 Ae. aegypti ^4,5,6,7에서 행동 반응을 유발하는 것으로 나타났지만 모기가 이러한 화합물을 정확히 어떻게 감지하는지는 크게 알려져 있지 않습니다. 우리 그룹의 최근 연구는 Ae. aegypti 숙주 탐색 활동에 관여할 수 있는 몇 가지 인간 냄새 물질을 확인했지만, 그 역할은 아직 추가 행동 분석으로 확인되지 않았습니다⁸. 이러한 필수 인간 냄새 물질이 Ae. aegypti의 말초 감각 시스템에서 어떻게 해독되는지는 아직 확립되지 않았습니다.

곤충은 후각 부속지에 있는 화학감각 감각(chemosensory sensilla)을 통해 냄새 물질을 감지합니다. 각 감각 내부에는 냄새 수용체(odorant receptor, OR), 이온 수용체(ionotropic receptor, IR), 미각 수용체(gustatory receptor, GRs)를 포함한 다양한 후각 수용체(olfactory receptor)가 후각 감각 뉴런의 막에 발현되어 있다⁹. 이러한 수술실은 곤충이 마주치는 많은 냄새, 특히 음식, 숙주 및 짝짓기 파트너와 관련된 냄새를 감지하는 역할을 합니다 10,11,12,13. 2전극 전압 클램프와 결합된 Xenopus 발현 시스템을 사용하여 Anopheles gambiae에서 OR의 기능을 탈고화하는 데 초점을 맞춘 이전 연구에서는 Anopheles OR이 인간 발산의 주요 구성 요소인 방향족에 특별히 조정되어 있음을 발견했습니다¹⁴. 최근 게놈 연구는 Ae. aegypti¹⁵에서 최대 117개의 OR 유전자를 확인했다. 결과적으로, 인간의 냄새나 산란 자극과 같은 생물학적으로 또는 생태학적으로 중요한 냄새 물질에 대응하여 이러한 Aedes OR의 기능을 체계적으로 다루는 방법은 Ae. aegypti의 화학 생태학 또는 신경 행동학을 더 깊이 이해하고자 하는 사람들에게 유용한 정보를 제공할 것입니다.

2전극 전압 클램프(TEVC) 기술은 원래 1990년대 중반에 멤브레인 이온 채널의 기능을 조사하기 위해 개발되었습니다^16,17. 그 이후로 TEVC는 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 등의 다양한 곤충 종의 OR을 조사하는 데 사용되었습니다^,33,34. OR에 대한 이러한 기능적 검사는 다음과 같은 곤충의 중요한 생태학적 질문에 답하는 데 실질적으로 기여했습니다. 1) 곤충은 어떻게 먹이 공급원을 찾습니까? 2) 짝짓기 파트너가 방출하는 휘발성 섹스 페로몬에 어떻게 끌리나요? 3) 그들은 자손을 위한 완벽한 산란 장소를 어떻게 찾습니까? 4) 무는 벌레로부터 인간을 효율적으로 보호할 수 있는 식물 유래 또는 합성 화합물이 있습니까? 이러한 질문에 대한 답은 모기와 같은 중요한 질병 매개체를 통제하는 데 매우 중요합니다.

인간 배아 신장 세포주 293(HEK293), 초파리 빈 뉴런 시스템, 아연-핑거 뉴클레아제, 전사 활성제와 같은 효과기 뉴클레아제 및 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 기반으로 하는 방법을 포함한 여러 다른 접근 방식도 OR 기능 연구에 사용되었습니다 12,20,35,36,37. 그러나 이러한 기술은 모두 경험 많은 분자 생물학자의 기술을 필요로 하며 잠재적으로 여러 가지 혼란스러운 요인을 포함합니다. TEVC/난모세포 발현은 냄새 유발 수용체 전류와 이온 전도도를 직접 측정할 수 있으며 cRNA에서 수용체를 발현하는 데 필요한 빠르고 빠른 설정 시간이라는 추가 이점이 있습니다. 따라서 본 연구에서는 TEVC를 사용하여 잠재적인 생물학적 관련성이 있는 여러 냄새 물질에 대한 Ae. aegypti OR55(AaegOR55)의 반응을 조사하여 AaegOR55•AaegOrco로 발현된 난모세포가 인간 냄새 물질인 벤즈알데히드에 대한 용량 의존적 반응을 보였다는 것을 밝혔습니다.

프로토콜

이 절차에 대한 프로토콜인 실험실 동물의 관리 및 사용은 승인 및 모니터링됩니다(Auburn University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회: 승인된 프로토콜 # 2016-2987).

참고: 맞춤형 유전자 합성은 모기 OR 유전자 복제에 대한 실행 가능한 대안입니다.

1. 모기와 후각 부속물(안테나) 수집

1. Ae. aegypti 모기 (Dr. James Becnel, USDA, ARS, Mosquito and Fly Research Unit에서 얻음)를 25 ± 2 ° C에서 유지하고 12 : 12 (L : D) h (오전 8시 점등)의 광주기를 유지합니다.
2. CO₂를 사용하여 혈액을 공급하지 않고 ~ 800 ~ 6 일 된 암컷 모기를 마취합니다. 가위를 사용하여 현미경(40x)으로 모기 더듬이(후각 조직)를 자르고 드라이아이스에 보관된 1.5mL 원심분리기 튜브에 수집합니다.
   알림: 수집된 안테나는 -80°C의 냉동고에 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다.

2. 또는 Ae. aegypti의 더듬이에서 복제

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 total RNA 키트를 사용하여 안테나에서 total RNA를 추출합니다.
2. 제조업체의 프로토콜에 따라 DNase 및 기타 이온을 제거하기 위해 상용 DNA-free 키트를 사용하여 전체 RNA를 분해합니다.
3. Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis System^13,30을 사용하여 1.5μg의 DNA가 없는 RNA에서 cDNA를 합성합니다.
4. VectorBase(https://www.vectorbase.org/)에서 사용할 수 있는 염기서열과 효소 절단 부위의 특수 요구 사항에 따라 OR 유전자에 대한 PCR 프라이머를 설계합니다. 대부분의 진핵생물에서 번역을 시작하는 Kozak 서열(GCCACC)을 각 전방 프라이머(³⁰)의 절단 부위와 시작 코돈 사이에 추가합니다.
5. 제조업체의 프로토콜에 따라 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 OR 유전자의 암호화 염기서열을 복제합니다.
6. 1% 아가로스 겔을 통해 PCR 산물을 검출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다.
7. 제조업체의 프로토콜에 따라 제한 효소에 의해 분해된 후 PCR 산물을 pT7T 벡터로 클로닝하여 재조합 플라스미드 구조를 수행합니다.
8. Sanger 염기서열분석(sequencing)을 통해 재조합 플라스미드를 검증하고 VectorBase 데이터베이스를 사용하여 확인합니다.

3. cRNA 합성

1. 구성된 플라스미드를 특정 제한 효소(들)로 선형화합니다.
   참고: Plasmid DNA는 전사할 유전자의 다운스트림에 있는 제한 효소와 선형화되어야 합니다.
2. 선형화된 플라스미드를 사용하여 이전 설명^13,30에 따라 상용 T7 키트로 cRNA를 합성합니다.
3. 원심분리 튜브에 OR과 Orco(1:1)의 cRNA를 사전 혼합하고 혼합된 cRNA를 각 PCR 튜브에 대해 2μL 부피(각각 250ng/μL)로 분취합니다. 분주된 cRNA를 사용하기 전에 -80°C에서 보관하십시오.

4. 제노푸스 난모세포 컬렉션

참고: 이 절차는 Schneider et ^al.38의 지침을 따릅니다.

1. Xenopus laevis를 에틸 m-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염 1g과 함께 초정제수 1L에 20-30분 동안 마취합니다(그림 1A). 손가락을 사용하여 개구리의 발가락 중 하나를 꼬집습니다. 반응이 없으면 개구리는 충분히 마취되어 수술할 준비가 된 것입니다. 마취된 개구리를 얼음 바닥으로 옮깁니다.
2. 수술
   1. 10% 포비돈-요오드 용액으로 개구리 복부 부위를 문지르고 깨끗한 면봉으로 용액을 닦습니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
   2. 일회용 메스로 작은 복부 절개 (10-15mm, 그림 1B)를 만듭니다. 피부, 근막-근육층을 따로 침투합니다. 절개 부위는 복부 아래쪽에 있으며 정중선 측면에 있습니다.
      알림: 내부 장기를 손상시키지 마십시오.
   3. 집게로 난소엽의 일부를 잡고 바깥쪽으로 부드럽게 당깁니다. 난소를 들어 올려 가위로 체벽 높이에서 자릅니다. 충분한 난소 물질(~200개의 난자, 그림 1C)을 얻을 때까지 여러 번 반복합니다. 난소 물질을 세척 완충액(96mM NaCl, 2mM KCl, 5mM MgCl₂•6H_2O, 5mM HEPES 나트륨염, 10μg/mL 겐타마이신, pH 7.6)으로 옮깁니다.
   4. 일반적으로 10-14일 이내에 자연적으로 분해되고 빠지는 흡수성 봉합사로 수술 상처(근육과 피부 모두)를 봉합합니다.
   5. 각 수술 후에는 개구리를 1 L의 회수 용액(3.4 g의 통조림 및 절임 소금과 2 g의 인스턴트 해양 소금 포함)에 넣어 깨어나게 한 다음 개구리 시설로 돌려보냅니다.
      참고: 각 개구리에 대해 최대 4번의 수술을 수행할 수 있습니다. 각 개구리의 수술 간격은 2개월 이상이어야 합니다.
3. Enzymatic defolliculated digestion and oocytes culturing (효소 혈중 분해 및 난모세포 배양)
   1. 난모세포(~200개의 난자, 그림 1C)를 작은 조각으로 분리합니다.
   2. 여포 세포층을 제거하기 위해 10mL의 세척 버퍼(섹션 4.2.3) 및 2mg/mL 콜라겐분해효소 B를 포함한 모든 난모세포를 상온에서 40-60분 동안 소화 용액으로 옮깁니다. 현미경으로 샘플을 검사하여 난모세포의 80%가 완전히 모낭화되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 대부분의 난모세포가 준비될 때까지 10분마다 확인하십시오.
   3. 난모세포를 1x Ringer's solution(96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl₂·6H₂O, 5 mM HEPES sodium salt, pH 7.6), 세척 완충액(Section 4.2.3), 변형 Barth's saline(78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.33 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O, 0.41 mM CaCl₂·2H₂O, 0.82 mM MgSO₄·7H₂O, 2.4 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes 나트륨 염, 1.8 mM 나트륨 피루베이트, 10 μg/mL 겐타마이신, 10 μg/mL 스트렙토마이신, pH 7.6) 순서대로(각 완충액당 5회, 각 10mL 사용). 미성숙하고 품질이 좋지 않은 난모세포를 제거하기 위해 완충액으로 난모세포를 광범위하게 헹굽니다.
   4. Dumont의 분류에 따라 V-VI 단계에서 난모세포를 채취합니다. 흰색/어두운 색이 뚜렷하게 구분되고 시각적으로 명백한 손상이 없는 V-VI 단계의 건강/양질 난모세포(그림 1D)를 변형된 Barth's saline(섹션 4.3.3)이 포함된 100mm x 15mm 페트리 접시로 이동합니다. 품질이 나쁜 난모세포는 폐기합니다(그림 1E). 소화된 난모세포를 미세주입 전 약 24시간 동안 18°C의 곤충 성장실에서 유지합니다.

5. cRNA 미세주입 및 이종 난모세포에서 냄새 수용체(OR) 및 OR 공동 수용체(ORCO)의 발현

1. 금속 매트릭스를 100mm x 15mm 페트리 접시에 넣고 매트릭스가 잠길 때까지 수정된 바르트 식염수(섹션 4.3.3)를 추가합니다. 매트릭스에 난모세포를 이식하고 크기에 맞지 않는 난모세포는 버립니다. 위쪽에 있는 식물 기둥이 있도록 난모세포를 배열합니다(그림 1F).
2. 마이크로파이프 풀러(Heat = 525, Pull = 50, Velocity = 50, Time = 250)를 사용하여 각 샘플에 대해 새 유리 모세관(1.0mm OD x 0.5mm ID, 길이 = 100mm)을 당기고 마이크로피펫 베벨러로 25° 각도로 연마합니다. 나노리터 주입기에 모세관 튜브를 장착합니다.
3. 주입하기 전에 냉동고에서 OR과 Orco(섹션 3.3)의 미리 혼합된 cRNA 튜브 하나를 제거하고 완전히 녹을 때까지 얼음 위에 놓습니다. 나노리터 주입기의 채우기 버튼을 눌러 모세관에 OR/Orco 혼합물을 채웁니다.
4. RNAse-free station에서 나노리터 주입기로 각 난모세포에 대해 사전 혼합된 cRNA 10ng(5ng OR + 5ng Orco; ~20nL)를 주입합니다. (그림 1F).
   참고: 주입하기 전에 EMPTY 버튼을 눌러 모세관이 막히지 않도록 작은 혼합물을 배출합니다. cRNA가 난모세포에 완전히 들어갈 때까지 약 5초 동안 기다립니다.
5. 주입 후, 변형된 Barth's saline이 있는 멸균 24-well 세포 배양 플레이트에 18°C에서 3-7일 동안 보관한 후 전체 세포를 기록합니다.

6. 2전극 전압 클램프 시스템을 사용한 전체 셀 전류 기록(그림 2)

1. 2전극 전압 클램프 기록 전에 개별 냄새 화합물을 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 일련의 원액(100μg/μL)을 얻습니다. 이러한 원액을 1x ND96 완충액(91mM NaCl, 2mM KCl, 1.8mM CaCl,₂·2H_2O, 2mM MgCl₂·6H_2O, 5mM HEPES 나트륨염, pH 7.6)으로 1000배 희석하여 일련의 작업 용액(0.1μg/μL)을 얻습니다.
2. 금속 실드, 현미경, 광원 및 폐기물 펌프를 포함한 TMC 진동 차단 테이블의 모든 것이 전체 셀 신호 기록에 대한 외부 전기 노이즈의 영향을 줄이기 위해 신중하게 접지되었는지 확인합니다.
3. 마이크로파이프 풀러(Heat = 525, Pull = 50, Velocity = 50, Time = 250)를 이용하여 유리 모세관(1.20 mm OD x 0.94 mm ID, 길이 = 750 mm)을 당겨 미세전극을 준비합니다. 모세관을 3M KCl로 채웁니다. Ag/AgCl 와이어를 짙은 회색으로 변할 때까지 2% 염소 표백제에 5-10분 동안 염소화합니다(옅은 회색 Ag/AgCl 와이어는 염소화해야 함).
4. 난세포 클램프와 Digidata 디지타이저를 켜서 기기를 켭니다(그림 3A). 소프트웨어(예: Clampex 10.3)를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 1x ND96 버퍼(섹션 6.1)용 스위치와 폐기물 버퍼용 펌프를 켭니다.
5. 흐르는 버퍼에 미세전극을 삽입한 후 V_m 전극 테스트 버튼과 V_e 전극 테스트 버튼을 눌러 미세전극의 저항을 확인하여 사전 테스트를 실시합니다. _Vm 은 40mV<되어야 하고_Ve는 40μA<이어야 합니다. 사전 테스트 후 1x ND96 버퍼(섹션 6.1) 흐름과 폐기물 펌프를 끕니다.
6. 각 난모세포를 1x ND96 완충액(섹션 6.1)으로 채워진 관류 챔버(그림 2)에 놓고 식물 기둥이 유리 애벌레를 위로 향하도록 난모세포를 부드럽게 배치합니다. 전극을 난모세포에 천천히 삽입합니다(그림 3B). V_m 매개변수를 0으로 조정한 다음 V_e 매개변수를 0으로 조정합니다. 클램프 버튼을 OFF에서 FAST로 변경합니다. 게인 버튼을 ~ -80mV로 조정합니다.
7. 일정해야 하는 V_e의 값을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 두 개의 미세 전극 중 적어도 하나에 누출이 있는 것입니다. 이 경우 결함이 있는 구성 요소를 새 모세관으로 교체하십시오.
8. ~−80mV의 유지 전위에서 난모세포 클램프를 사용하여 주입된 난모세포의 전체 세포 전류를 기록합니다(그림 2).
9. 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.
   1. 1x ND96 버퍼(섹션 6.1)의 흐름을 재개하고 폐기물 펌프를 켭니다.
   2. 관류 시스템을 통한 부취제 용액 도포: 1x ND96 버퍼(섹션 6.1)를 끄고 부취제 용액을 10초 동안 흐릅니다. 그런 다음 피크 값을 기록합니다. 테스트 냄새 물질에 대한 OR의 반응을 얻으려면 피크 값에서 기준선 값을 뺍니다.
   3. 냄새 용액의 흐름을 중지하고 1x ND96 버퍼(섹션 6.1)로 전환합니다. 현재의 흔적이 이전의 냄새 자극으로부터 회복될 때까지 완충액을 사용하여 난모세포를 세척합니다. 그런 다음 난모세포는 다른 냄새 용액에 의해 자극을 받을 준비가 됩니다. 일반적으로 하나의 난모세포를 사용하여 20-30개의 화학적 자극을 감지할 수 있습니다.
      참고: 농도 의존적 반응을 테스트할 때 더 높은 농도로 이동하기 전에 항상 가장 낮은 농도를 먼저 적용해야 합니다.

결과

우리는 최근 SSR(Single sensillum Recording) 기법을 사용하여 Ae. aegypti 숙주 탐색 행동⁸에 중요하다고 생각되는 인간 냄새 물질을 정확히 찾아냈습니다. 그러나 Ae. aegypti의 말초 감각 시스템에서 인간의 냄새 물질을 감지하는 과정을 주도하는 분자 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. OR은 대부분의 곤충에서 냄새 리간드 검출에 중요한 역할을 합니다 10,11,12. 이러한 기능을 수행하려면 각 OR이 Orco와 함께 발현되어 헤테로머 리간드 게이트 이온 채널을 형성해야 합니다(그림 4). 일단 특정한 ligands에 의해 결합되면, 세포막에 표정된 heteromeric 이온 수로는 활성화되고 열...

토론

TECHC는 막 수용체의 기능을 검사하는 데 널리 사용되는 고전적인 기술입니다. 여기에 제시된 절차와 상당한 유사성을 공유하는 상세한 프로토콜이 이미 발표되었지만⁴³ , 여기에서 제안된 방법은 몇 가지 중요한 수정 사항을 소개합니다. 예를 들어, 여기에서, OR과 Orco 모두의 cRNA는 사전 혼합되어 합성 직후 소량 샘플로 분주화되고, 주입 직전에 파라막상에서 이들을 별도로 혼합하는 것이 아니라, 사용할 때까지 -80°C에서 보관된다⁽⁴³). 또한, 난모세포를 채취한 후 근육과 피부 모두의 상처를 봉합하기 위해 흡수성 봉합사를 사용하기로 선택하는데, 이는 봉합사가 개구리에 흡수될 수 있고 나중에 제거할 필요가 없기 때문에 근육을 봉합하는 데 특히 유용합니다. 또한 각 개구리에서 채취한 난소의 양은 각 실험의 필요에 따라 유연합니다. Nakagawa and Touhara(2013)의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 세포 배양 플레이트	CytoOne	CC7682-7524	난모세포 배양에 사용
아프리카 발톱 개구리	Nasco	LM00535	Xenopus 난모세포
Ag/AgCl 와이어 전극	Warner Instruments	64-1282	미세 전극에 사용
Clampex 10.3	Axon	N.A.	신호 기록에 사용
클램프핏 10.3	축삭 인스트루먼트 Inc.	해당 없음	데이터 분석에 사용
Collagenase B	Sigma	11088815001	난모세포 소화에 사용
Digidata 디지타이저	Axon CNS	Digidata 1440A	데이터 수집에 사용
E.Z.N.A. 플라스미드 DNA 미니 키트	Omega	D6942-01	플라스미드 제제에 사용
Ethyl-M-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	886-86-2	개구리 마취에 사용
유리 모세관	FHC	30-30-1	미세 주입에 사용
유리 모세관	Warner Instruments	64-0801	미세 전극 준비에 사용
GyroMini Nutating Mixer	Labnet	S0500	난모 세포 소화에 사용
곤충 성장실	Caron 제품	모델 6025	난모 세포 배양에 사용
Leica 현미경 Leica		S6 D	모기 안테나를 절단하는 데 사용
광원	Schott	A20500	관찰용 광원 제공
마그네틱 스탠드	Narishige	GJ-1	기준 전극을 고정하는 데 사용
Micromanipulator	Leica	115378	전극의 작은 움직임에 사용
Micropipe 풀러	Sutter	모델 P-97	모세혈관을 당기는 데 사용
마이크로피펫 베벨러	Sutter	모델 BV-10	모세혈관을 날카롭게 하는 데 사용
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Invitrogen	AM1344	cRNA 합성에 사용
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond	3-000-204	미세주입에 사용
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis System	Invitrogen	18091050	사용 cDNA 합성
올림푸스 현미경	올림푸스	SZ61	미세주입에 사용
One Shot TOP10 화학적으로 유능한 대장균 세포	Invitrogen	C404003	형질전환에 사용
난자 클램프 증폭기	워너 인스트루먼트	모델 OC-725C	TEVC 기록에 사용
QIAquick 겔 추출 키트	Qiagen	28704	겔에 사용 정화
TMC 진동 격리 테이블	TMC	63-500	장비에서 진동을 분리하는 데 사용됩니다
TURBO DNA-free kit	Invitrogen	AM1907	RNA에서 DNase 및 기타 이온을 제거하는 데 사용됩니다