쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

Summary

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

Abstract

소수성 조직 청산 방법은 변경되지 않은 조직 샘플에 대한 관심 분자의 연구를 허용하는 쉽게 조절 가능하고 빠르며 저렴한 절차입니다. 기존의 면역 라벨링 절차는 샘플을 얇은 섹션으로 절단해야 하므로 손상되지 않은 구조물에 라벨을 부착하고 검사하는 기능이 제한됩니다. 그러나, 뇌 조직이 처리 하는 동안 그대로 남아 있는 경우, 구조 및 회로 분석을 위해 그대로 남아 있습니다. 이전에 확립 된 클리어링 방법은 조직을 완전히 지우는 데 상당한 시간이 걸리며 가혹한 화학 물질은 종종 민감한 항체를 손상시킬 수 있습니다. iDISCO 방법은 조직을 신속하고 완전히 지우고 많은 항체와 호환되며 특별한 실험실 장비가 필요하지 않습니다. 이 기술은 마우스 조직에서 사용하기 위해 처음에 검증되었지만 현재 프로토콜은 이 방법을 제어 및 형질 전환 쥐 뇌의 이미지 반구에 적응시합니다. 이 외에도 현재 프로토콜은 기존 프로토콜을 여러 번 조정하여 배경 염색이 적은 선명한 이미지를 제공합니다. 이바-1 및 티로신 하이드록실라제에 대한 항체는 HIV-1 형질전환 쥐및 F344/N 대조군 쥐에서 현재소수성 조직 청산 방법을 사용하여 검증되었다. 뇌는 서로 분리된 것보다 구조가 더 자주 함께 작동하는 얽힌 네트워크입니다. 개별 조각의 조합반대로 전체 시스템으로 뇌를 분석하는 것은이 전체 뇌 청산 방법의 가장 큰 이점입니다.

Introduction

여러 조직 클리어링 기술은 뇌의 사용을 위해 검증되었습니다: 소수겔, 친수성 및 소수성. 이러한 기술은 용매의 투여를 통해 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 전환하는 것을 목표로 합니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 시료의 명확한 이미지를 얻을 수 있습니다. CLARITY와 같은 하이드로겔 기반 기술은 아크릴 기반 하이드로겔에 연결하여 조직 내 생체 분자를 확보하여 단백질^1의구조적 손상 과 손실을 방지합니다. 그러나 하이드로겔 기술은 더 연약한 조직을 손상시킬 수 있는 가능성이 있는 것보다 가혹한 화학 물질을 이용하며, 조밀한 조직 샘플은 하이드로겔 프로토콜과 호환되지 않을 수 있습니다. 특정 하이드로겔 기술은 고가의 장비가 필요하거나 조직 팽창으로 이어질 수 있습니다. 큐빅과 같은 친수성 기술은 조직²내의 수소 결합 형성을 통해 3D 구조를 보존한다. 조직 확장은 또한 특정 친수성 프로토콜에서 발생할 수 있습니다. 친성 기종의 청산 능력은 종종 소수성 기술이 가지고있는 능력과 일치하지 않으며, 이는 조밀하고 두꺼운 조직에 중요하다^3.

소수성 기술은 일반적으로 빠르며 특수 장비가 필요하지 않으며 취급 및 보관이 쉬운 샘플을 생성합니다. iDISCO는 다른 소수성 프로토콜에서 발생할 수 있는 수축을 제거하는 소수성 기술입니다. 원래, iDISCO 조직 청산 기술은 쥐의 배아 및 조밀한, 성인 장기에 대한 Renier 외^4에 의해 설명되었다. 이 기술은 초기 탈수 단계에서 조직에서 물을 제거하여 빛 산란을 줄입니다. 조직은 깊은 항체 침투를 허용하기 위하여 전처리 도중 permeabilized됩니다. 극한 스펙트럼에서 알렉사 플루오 염료는 낮은 파장^5에서조직의 자가 불화를 피하기 위해 면역 라벨링에 사용된다. 소수성 청산 프로토콜을 거친 조직은 쉽게 처리될 수 있으며 Alexa Fluor 염료의 수명으로 인해 여러 번 이미지화될 수 있습니다. 제대로 저장하면 조직은 초기 처리 후 몇 달에서 1 년 동안 이미지를 제공 할 수 있습니다.

본 프로토콜에서 티로신 하이드록실라제(TH) 항체, 이바1 항체 및 콜레라 톡신 서브유닛 B(CTB)는 남성과 여성 제어 및 HIV-1 형질(Tg) 쥐 뇌 모두에 사용되었다. HIV-1 Tg 랫트는 HIV-1 바이러스 게놈을 구성하는 9개의 유전자 중 7개를 가지고 있으며, 이는 장기 HIV-1 단백질 노출^6,7,8의비감염성 모델로 이어진다. 도파민성 변화는 이전에 HIV-1 Tg 랫트에서 입증되었으며, HIV-1 자체는 염증성 질환이므로 항체 선택은 실험 설계^{9,10,11,12와}관련이 있었다. CTB는 신경질 옆 바인딩을 통해 뉴런에 부착하고 뇌의 포퍼런트 프로젝션을 추적하는 데 사용할 수있는 추적자입니다. CTB는 이전에 핵 accumbens에서 실질적인 니그라 영역, 도파민 경로와 크게 관련된 뇌의 두^{영역(13,14,15)에}대한 투영을 연구하는 데 사용되었습니다.

이 프로토콜에서 TH는 도파민 생산을 위한 마커 역할을 하며, Iba1은 활성화된 마이크로글리아를 표시합니다. TH 항체는 티로신 하이드록실라제에 해당하는 약 62kDa에서 단일 대역에 선택적으로 라벨을 부착하는 데 사용되었습니다. Iba1 항체는 Iba1 카복시-말단 서열에 해당한다. 두 항체는 토끼에서 자랐고 폴리클론이었다. CTB는 핵 accumbens 영역에서 실질적인 니그라 영역까지 뉴런의 역행 추적에 사용됩니다. 현재 프로토콜은 또한 두 가지 방법으로 원래 iDISCO 프로토콜의 조정을 위한 지침을 제공합니다: 1) 차단 단계에서 혈청 시약을 변경하여 배경 염색의 전반적인 감소, 그리고 2) 큰 조직 샘플에 적합 하도록 인큐베이션 시간의 스케일링. 전반적으로, 본 프로토콜은 소수성 청산 기술이 쥐의 뇌 조직에서 실현 가능하고, HIV-1 바이러스 성 단백질과 눈에 띄는 해로운 상호 작용이 없으며, TH 항체, Iba1 항체 및 CTB와 호환된다는 지속적인 증거를 제공합니다.

Protocol

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 주식 솔루션 준비

1. 용액 1 (1 L): 900 mL의 탈이온화 H₂O는 10배 인산완충식식염(PBS)과 트리톤 X-1002mL의 100mL를 추가한다.
2. 솔루션 2 (1 L): 900 mL의 deionized H₂O, 10x PBS의 100 mL, 20 tween-20의 2mL 및 10 mg / mL Heparin 재고 용액의 1 mL을 추가하십시오.
3. 용액 3 (500 mL): 용액 1의 400 mL에 11.5 g의 글리신과 100 mL의 디메틸술플옥사이드 (DMSO)를 추가하십시오.
4. 솔루션 4 (50 mL): 용액 1의 42 mL에 해당 혈청 3mL 및 DMSO 5 mL을 추가하십시오.
5. 1차 항체 용액(50mL): 용액 2의 46mL에 2.5mL의 DMSO 와 1.5mL의 해당 혈청을 추가한다.
6. 이차 항체 용액 (50 mL): 용액 2의 48.5 mL에, 해당 혈청의 1.5 mL을 추가합니다.
   참고: 용액 4, 1차 용액 및 이차 용액의 경우 이차 항체(예: 염소, 말, 소)와 일치하는 혈청을 사용합니다.

2. 샘플 준비

참고: PFA에 대한 노출을 제한하기 때문에 연기 후드에서 2.1~2.7단계를 수행합니다.

1. 세보플루란을 사용하여 젊은 (3-6 주) 쥐를 심층 마취; 쥐가 반응하지 않고 발가락과 꼬리 꼬집어 반응하지 않을 때 2.2로 진행하십시오.
2. 쥐를 supine 위치에 놓고 홍채 가위를 사용하여 복부 벽을 통해 절개를합니다.
3. 마요 가위를 사용하여 늑골 케이지의 바닥을 통해 갈비뼈 의 양쪽에 있는 쇄골까지 잘라냅니다.
4. 흉골과 갈비뼈를 심장과 폐에서 헤모스트와 분리합니다.
5. 관류 펌프에 부착된 23G 바늘로 왼쪽 심실을 관통하고 아이리스 가위로 오른쪽 아트리움을 잘라냅니다.
6. 100mMMM(1x) PBS의 약 75mL로 경동맥 관류를 수행합니다.
7. 1x PBS로 완충된 약 100mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 경전 관류를 계속합니다.
8. 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다.
9. 뇌를 적중 한 위치에 놓고 면도날과 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 4 개의 동일한 섹션 (너비약 3mm)으로 슬라이스합니다.
10. 각 섹션을 4% PFA로 1x PBS로 밀봉된 5mL 플라스틱 튜브에서 셰이커에 4°C로 하룻밤 동안 고정합니다.
11. 1 시간 동안 셰이커에 실온 (RT)에서 1 x PBS에서 4 % PFA로 계속 수정하십시오.
12. 각 섹션을 RT에서 1x PBS로 30분, 3회 세척합니다.

3. 탈수 및 탈색

1. RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
2. 샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.
3. 60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.
4. RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
5. 100% 메탄올에 100% 메탄올을 1시간 동안 배양하여 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 샘플을 4°C에서 100% 메탄올로 약 10분 동안 식힙니다.
7. 66% 디클로로메탄(DCM)/33% 메탄올 용액을 준비한다.
8. RT의 DCM/메탄올 용액에서 밤새 샘플을 배양하고 흔들어 보임합니다.
9. RT에서 메탄올로 30분, 2회 세척합니다.
10. 샘플을 4°C에서 100% 메탄올로 약 10분 동안 식힙니다.
11. 4° C에서 하룻밤 동안 메탄올에서 고추, 갓 준비 된 5 % 과산화수소표백.
12. RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
13. 60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.
14. 샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.
15. RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
16. RT에서 1시간 동안 1배 의 PBS로 샘플을 배양합니다.
17. RT에서 1시간, 2회 용액 1시에 세척합니다.

4. 콜레라 톡신 서브유닛 B 라벨링

1. 1 mL 주사기의 바늘 끝을 핵 accumbens 부위에 삽입합니다.
2. 20s 이상 1%의 비오틴-CTB의 2.5 μL을 천천히 주입하십시오.
3. 바늘 끝을 1 분 동안 제자리에 두고 누출을 방지하기 위해 10 s 이상 천천히 제거하십시오.

5. 항체 응용 프로그램

1. 수조에서 37°C에서 2일 동안 용액 3에서 샘플을 배양한다.
2. 수조에서 37°C에서 2일 동안 용액 4에서 샘플을 배양한다.
3. 수조에서 37°C에서 7일 동안 1차 항체를 배양한다.
4. 용액 2를 5회 세척하여 세척당 1h로 배양합니다. 하룻밤 RT에서 솔루션 2에 저장합니다.
5. 수조에서 37 °C에서 7 일 동안 이차 항체로 배양하십시오.
6. 용액 2에서 5회 세척하여 세척당 1h를 배양합니다. 하룻밤 RT에서 솔루션 2에 저장합니다.
   참고: 최종 저장소를 포함하여 5.6 단계 이후의 모든 단계는 저조도에서 발생해야 합니다. 샘플 튜브는 알루미늄 호일로 차폐될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 항체에 사용되는 농도는 1:100에서 TH, 1:200에서 Iba1, 및 1:100에 이차 항체가 있었다. 5.1-5.6 단계에 추가 솔루션 2를 추가하여 튜브가 완전히 채워지도록 합니다.

6. 조직 청산

1. RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
2. 샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.
3. 60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.
4. RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.
5. RT에서 1시간 동안 100% 메탄올로 샘플을 배양합니다.
6. RT에서 하룻밤 사이에 신선한 100 % 메탄올로 배양하십시오.
7. 66% DCM/33% 메탄올에서 3시간 동안, 실온에서 흔들림을 가합니다.
8. 디벤질 에테르 (DBE)에서 흔들리지 않고 인큐베이션하십시오. 샘플을 DBE에 보관하여 이미징이 명확해질 때까지 보관하십시오.

7. 마운팅

1. Visijet M3 크리스탈 수지 (idisco.info 웹 사이트에서 사용할 수있는 템플릿)으로 만든 3D 인쇄 챔버를 가져옵니다.
2. 에폭시를 사용하여 현미경 슬라이드에 챔버를 고정합니다.
3. 샘플을 챔버 중앙에 있는 사각형 공간에 놓습니다.
4. DBE로 챔버를 완전히 채웁니다.
5. 챔버 위에 0.17mm 두께의 커버슬립을 놓고 커버슬립이 챔버 벽과 완전히 접촉할 때까지 압력을 가합니다.
6. 에폭시를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 챔버로 밀봉합니다.
7. 기포가 충전 입구에서 탈출할 수 있도록 챔버를 회전합니다.
8. 추가 DBE로 챔버를 채웁니다.
9. 충전 입구를 에폭시로 밀봉하고 치료할 수 있습니다.
   참고: 장착 하는 동안 초과 DBE 유출 됩니다.

8. 이미징

1. 공초점 현미경 시스템을 사용하여 4배배율에서 z 스캔을 수행합니다(첨부된 3D 비디오참조).
2. 이차 항체에 의해 지정된 파장과 유사한 파장에서 방출하는 레이저 세트를 사용하여 시료의 형광 내수를 달성한다. TH 흥분은 632 nm에서 방출하는 Hene 레이저 세트를 활용하여 달성되었다.
3. 검출기를 레이저 방출에 가까운 파장에 설정합니다. 본 프로토콜의 경우 TH용 검출기는 650nm로 설정되었다.
4. 가시신호가 있을 때까지 검출기의 게인을 올립니다. 이미지에 대한 650LP 게인은 7.50 B로 설정되었습니다.
5. 공초점 이미징 소프트웨어에서 스캔 옵션을 사용하여 샘플이 초점을 맞출 때까지 현미경 단계를 이동합니다.
6. 모든 평원의 조직을 탐색하고 공초점 이미징 소프트웨어를 사용하여 단일 이미지 또는 z 스택 이미지를 가져옵니다.
7. 이미징이 완료되면 챔버에서 샘플을 제거합니다. DBE로 가득 찬 튜브에 다시 넣고 알루미늄 호일로 덮인 어두운 곳에 RT에 보관하십시오.
   참고: 꽃집 신호가 여전히 강한 한 샘플을 다시 마운트하고 이미지화할 수 있습니다.

Results

F344/N 과 HIV-1 쥐 뇌 조직의 큰 부분을 완전히 지우는 이 변형된 소수성 조직 청산 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1은 실질적인 니그라 영역에서 TH에 대한 일반적인 공초점 이미지를 표시한다. 도 1A는 조밀하고 양적인 염색을 나타냅니다. 이와 같은 조밀한 영역은 "Z" 평면을 통해 초점을 맞추어 양성 염색 및 적절한 세포 형태를 확인함으로써 구문 분석될 수 있다. 도 1B는 TH 뉴런의 뚜렷한 형태에 의해 식별될 수 있는 희소한 양성 염색을 나타낸다. 도 1C는 긍정적으로 염색되지 는 않지만 배경 신호로 인해 여전히 밝은 파란색으로 어둡게 되는 조직을 나타냅니다. 완전히 검게 보이는 이미지 영역은 해당 영역에 조직의 부재를 나타냅니다. 이미지의 완전히 검은 영역은 샘플의 가장자리, 샘플에 있는 구멍 ...

Discussion

조직 정리는 기존의 IHC 프로토콜의 한계에 대한 해결책을 제공합니다. 투명한 시료는 빛의 산란과 흡수를 최소화하여,^18,19의그대로 조직에 대한 세포 수준 광학 액세스를 제공한다. 조직 클리어링 기술은 용매의 투여와 함께 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 돌립니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 샘플이 완전히 투명하게 나타나고^3을적절하게 배화할 수 있다. 본 소수성 프로토콜은 초기 탈수 단계에서 조직에서 물을 제거하여 광 산란을 감소시킵니다. 조직은 깊은 항체 침투를 허용하기 위하여 전처리 도중 permeabilized됩니다. 프로토콜을 거친 조직은 쉽게 처리될 수 있으며 여러 번 이미지화될 수 있다. 제대로 저장된 경우 조직은 초기 처리 후 최대 1년 동안 이미지를 제공할 수 있습니다.

본...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
콜레라 독소 소단위 B(재조합), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	, Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
염소 항토끼 Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
염소 혈청	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
관류 기계	VWR	70730-062	미니 펌프 가변 흐름
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH 1차 항체	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500