이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.
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방법 논문
유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신체에서 직접 재생을 유도하는 재생을 유도하는 재생 가능한 생체 재료의 사용은 번역 관점에서 매력적인 전략입니다. 이러한 물질은 이식 시 염증 반응을 유도하며, 이는 물질의 후속 흡수와 새로운 조직의 재생의 원동력이다. 이 전략, 또한 시투 조직 공학에서 로 알려진, 조직 설계 혈관 이식 등 심장 혈관 교체를 얻기 위해 추구. 염증 및 재생 공정 은 스캐폴드 (즉, 스트레치 및 전단 응력)에 대한 국소 생체 역학 적 단서에 의해 결정됩니다. 여기서는 관 비계에서 스트레치및 전단 응력을 분리할 수 있는 맞춤형 생물 반응기의 사용을 자세히 설명합니다. 이를 통해 인간 대식세포와 근섬유아세포아제를 이용한 역동적인 공동배양 실험에 기초하여 입증되는 잘 조절된 기계적 하중의 영향으로 관 비계의 염증및 재생 능력의 체계적이고 표준화된 평가를 가능하게 한다. 바이오 반응기의 구성 및 설정, 비계 및 세포 파종의 준비, 스트레치 및 전단 흐름의 적용 및 유지 보수, 분석을 위한 샘플 수확 등 이 접근법의 주요 실용적인 단계는 자세히 설명합니다.
서론
심혈관 조직 공학(TE)은 현재 사용되는 영구 심혈관 보철물(예를 들어, 혈관 이식, 심장 판막 교체)에 대한 대체 치료 옵션으로 추구되고 있으며, 이는 환자의 큰 코호트에 대해 최적이 아니다1,2,3,4. 많은 수요가 응용 프로그램은 조직 엔지니어링 혈관 이식편 (TEVGs)5,6 및 심장 판막 (TEHV)7,8을포함한다. 대부분의 경우, 심장 혈관 TE 방법론은 새로운 조직이 형성될 수 있는 유익한 발판역할을 하는 개역 가능한 생체 재료(천연 또는 합성)를 사용합니다. 새로운 조직의 형성은 체외에서 완전히 설계될 수 있으며, 세포와 함께 스캐폴드를 시드하고 이식 전에 생체 반응기에서 배양하여(체외TE)9,10,
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프로토콜
이 프로토콜에 설명된 연구에서, 관상 동맥 바이패스 수술 후 사페누스 정맥으로부터 분리된 말초 혈액 버피 코트와 인간 근섬유아세포로부터 분리된 1차 인간 대식세포가44개사용되었다. 버피 코트는 산퀸 연구 기관 의료 윤리위원회의 승인을 받은 서면 동의를 제공한 건강하고 익명화된 자원봉사자들로부터 얻어졌습니다. 인간의 베나 사페나 세포의 사용 (HVSC) 네덜란드에서 의료 사회 연맹 (FMWV)에 의해 개발 된 "인간의 조직의 코드 적절한 이차 사용"에 따라했다.
1. 생물 반응기를 설정하기 전에 일반적인 준비 및 필요한 조치
참고: 각각의 격리 및 배양 프로토콜에 대한 자세한 내용은 이전 작업19,43,44를참조하십시오. 프로토콜의 모든 계산은 8개의 혈역학적으로 로드된 스캐폴드와 2개의 정적 컨트롤(n=10)에 시드된 단핵구 및 근섬유아세포로 공동 배양 실험을 위한 예로 주어집니다.
- 세포 격리 및 세포 배양을 시작합니다. 단핵구및 근섬유아세포의 공동 배양 시료에 대한 ....
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결과
이 생물 반응기는 혈관 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별적이고 결합 된 효과를 연구하고 3D 생체 물질 스캐폴드에서 리모델링하기 위해 개발되었다. 생물 반응기의 설계는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있게한다(도 1A). 혈관 구조는 둘레 스트레치와 WSS가 독립적으로 제어될 수 있는 유량 배양챔버(도 1B)에위치한다. 유동 배양 챔버의 상부 구획은 비교적 짧은 정착 길이(도1C)에서흐름을 안정화하기 위해 유동 스트레이트너를 보유한다. 유동 스트레이트너의 직접 하류, 코 콘은 환상 채널(도 1D)를통해 균등하게 흐름을 분배한다. 프로토콜의 모든 단계가 올바른 방식으로 수행될 때, 유동 배양 챔버내의 혈관 비계는 스캐폴드와 유리 벽 사이의 환상 채널을 통해 연속단방향 흐름을 실.......
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토론
본 명세서에 기재된 생물반응기는 관내 반사성 스캐폴드에서 염증 및 조직 재생에 대한 전단 스트레스 및 순환 스트레칭의 개별 및 결합된 효과의 기여도를 체계적으로 평가할 수 있다. 또한 이 방법을 사용하면 대표적인 결과 섹션에서 예시된 바와 같이 혈관 구조에서 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 결과는 TEVG 구조의 성장과 리모델링 모두에 다양한 혈역학 적재 체제(즉, 전단및 스트레치의 다양한 조합)의 독특한 영향을 보여줍니다. 이 시험관 내 플랫폼을 통해 수집된 이러한 통찰력은 Situ TEVG에서 새로 개발된 스캐폴드 설계 파라미터의 최적화를 지원합니다. 적절한 실험 워크플로우를 보장하기 위해서는 중요한 단계와 이 프로토콜의 한계를 이해하는 것이 중요합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 샘플에 스트레치 적용과 관련이 있습니다. 스트레치 어플리케이션의 경우 설치가 누출되지 않는 것이 필수적입니다. 시스템에는 두 가지 약점이 있습니다: 압력 도관에 전기 스펀 이식편을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 LSH 2Treat 프로그램 (436001003)과 네덜란드 신장 재단 (14a2d507)의 일환으로 ZonMw에 의해 재정적으로 지원됩니다. N.A.K.는 유럽 연구 위원회 (851960)의 지원을 인정합니다. 네덜란드 과학연구기구(024.003.013)가 후원한 중력프로그램 '재료 중심재생'을 감사하게 인정합니다.
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| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) | Gibco | 단핵구/대식세포용 A1049101 세포 배양 배지 | |
| Safe lock Eppendorf tubes(1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 다양한 응용 분야(1단계에서 오토클레이브) |
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| 봉합사, 테이퍼 포인트 니들이 미리 부착된 5-0 프롤렌 | 에티콘, 존슨& Johnson | EH7404H | Prolene 봉합사 와이어 5-0 (길이 75cm, TF 테이퍼 포인트 바늘, 1/2 원, 바늘 길이 13mm) |
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| T150 세포 배양 플라스크 필터 캡 Nunc | 178983 | 가스 제거 배양 배지 | |
| T75 필터 캡 세포 배양 플라스크 | Nunc | 156499 | 정전기 제어 샘플을 배양하기 위해 |
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| 초순수 | Stakpure | Omniapure UV 18200002 | 매체 증발을 보정하고 아쿠아 스타빌과 혼합하여 유압 유체로 사용합니다. (1단계에서 오토클레이브 초순수) |
| 자외선 | Philips | TUV 30W/G30 T8 | 파종 전 이식편 및 생물반응기 부품 오염 제거 |
참고문헌
- Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Huygens, S. A., et al.
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