방법 논문

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

DOI:

10.3791/61839

⸱

2020년 9월 26일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

이 논문에서

요약

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이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.

초록

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살모넬라 타이피무륨의 트립토판 신체(TS) 바이엔자임 복합체(α2β2 TS)를 함유한 구조 연구는 촉매 메커니즘, 알로스터식 거동, 그리고 PLP 의존 효소에서 제품에 기판의 효소 변환에 대한 세부 사항을 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 작품에서, 고립된 α 및 고립된 β 서브유닛을 생성하는 새로운 표현 시스템은 2일 이내에 고립된 서브유닛으로부터 고량의 순수 서브유닛과 α2 β2stTS 콤플렉스의 정화를 허용하였다. 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 그 다음으로 친화태그, 황산암모늄 강수량 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 분열이 뒤따랐다. 효소 β 부위의 주요 잔류물의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 현장 직접 돌연변이 발생은 이전 구조 연구에서 수행되었다. 또 다른 프로토콜은 야생 유형과 돌연변이 α2β2세인트TS 단지를 정화하기 위해 만들어졌습니다. 암모늄 황산염 분획 및 SEC를 사용하는 간단하고 빠르고 효율적인 프로토콜은 하루에2β2StTS 단지의 α 정화할 수 있었습니다. 이 작업에 기재된 두 정제 프로토콜은 이전 프로토콜과 비교하여 PEG 8000및 spermine을 사용하여 동일한 복합체를 정화하여 정화 프로토콜을 따라 α2β2stTS 단지를 결정화할 때 상당한 이점이 있다. 야생 유형 및 일부 돌연변이 형태의 결정화는 PEG 8000 및 spermine을 사용하여 일부 돌연변이체의 정제를 손상시키는 약간 다른 조건에서 발생합니다. 엑스레이 결정학 연구에 적합한 결정을 준비하기 위해 결정화, 결정 품질 및 냉동 보호를 최적화하기 위해 몇 가지 노력을기울였습니다. 여기에 제시 된 방법은 일반적으로 트립토판 synthase 서브 유닛과 야생 유형 및 돌연변이 α2β2세인트TS 단지의 정화에 적용해야합니다.

서론

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트립토판 신타제(TS) 바이엔자임 복합체(α2 β 2)는알로스터 효소로, 박테리아, 식물, 곰팡이1,2,3에서아미노산 L-트립토판의 생합성에서 마지막 두 단계를 촉매한다. 박테리아 살모넬라 장내 세로바 티피무리움 (St)은인간과 다른 동물에서 심각한 위장 감염을 일으킨다. 인간과 더 높은 동물은 TS(EC 4.2.1.20)가 없기 때문에, S. typhimurium α2β2 TS 복합체 (α2β2StTS)의 억제는 크립토스포리디오스및 결핵4,생식기 및 안구 감염5,그리고잠재적인 그녀의 발동을 위한 잠재적 인 약물 대상으로 탐구되었습니다. α 서브유닛은 인돌-3-글리세롤-인산염(IGP)의 알돌리틱 분열을 글리세랄데히드-3-인산염(GAP)과 인돌로 촉매하여, 인돌닌 타우토머 중간체및 그 후 카본-카본 결합 분....

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프로토콜

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1. α 및 β 서브 유닛을 정화하는 빠른 프로토콜과 재결합 된 α2β2StTS 단지

  1. PETSUMO 발현 벡터로 DNA 감속
    1. α인코딩하는 번역적 결합 유전자(trpA 및 trpB)를 획득하여- pEBA-10 발현벡터(22)에서복제된 박테리아 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움으로부터 트립토판 신체의 β-서브유닛을 획득한다. pEBA-10 벡터를 DNA 템플릿으로 사용합니다.
      참고: 대안적으로, 아래 나열된 프라이머는 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피무륨 게놈으로부터 두 유전자를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 모든 분자 생물학 단계는 분자 복제에 설명된 대로 수행되었습니다: 실험실 매뉴얼23.
    2. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 α-서브유닛(αStTS)의 전체길이 폴리뉴클레오티드 서열을 개별적으로 증폭시키고, α 세인트TS-FW-Bam과 α세인트TS-Rev-Eco와 β-서브유닛(β<....

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결과

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α정화- 및 트립토판 신체의 β서브 유닛
살모넬라 타이피무륨 트립토판 신체의 α-서브유닛(αSt TS)과 β-서브유닛(βStTS)은 수정된 pET SUMO 벡터에서 분리하였다. 도 1A는 His6-SUMO-αStTS(레인 αON) 및 His6-SUMO-βStTS(레인 βON) 융합 단백질에 대응하는 두 개의 강력한 밴드의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 이 작업에 기재된 정화 프로토콜은 2일 이내에 두 하위 단위의 정제를 개별적으로 허용하였다. 첫날은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 강수량, 그 순모 태그 분열, 그의 수모 태그 흔적 제거, 단백질 농도에 의해 각 단.......

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토론

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우리는 성공적으로 구조 기능 상관 관계 연구를위한2β2 βQ114A, α2β2 βK167T,α2 β2 βS377A 세인트TS 복합체를 α 돌연변이 형태를 성공적으로 설계했다. 처음에, 우리는 이전 정화 프로토콜을 사용하여 돌연변이를 정화하기 위해 노력했다22,이는 정제 하는 동안 PEG 8000 및 spermine와 α2β2세인트TS 복합 결정화를 필요로. 결정화 속도는 돌연변이 형태와 용액의 복합체 농도에 따라 다르지만, 결정이 큰 용액 부피에서 나타나는 시기를 예측하기 어렵다. 결정화는 장시간(48-96h) 후에 달성되거나 결정화 개시 후 PEG 8000의 추가 금액을 추가하는 데 필요한 중 하나를 달성할 수있다.15.

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공개 사항

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저자는 공개하고 경쟁 금융 이익을 선언 할 아무것도 없다.

감사의 글

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이 작품은 미국 국립 보건원 (GM097569)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 10 kDa 필터MilliporeSigmaUFC901024원심 필터 유닛
15 mL 100 kDa 필터MilliporeSigmaUFC910024원심 필터 유닛
2 mL 극저온 바이알CorningCLS430489극저온 바이알
2 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-408-141마이크로 원심분리기 튜브
24-well Cryschem Plate,Hampton ResearchHR3-15824-well sitting drop plate
2-mercaptoethanolFisher ScientificO3446I-100Chemical
50mL 원심분리기 원추형 튜브, Thermo Scientific12-565-270원심분리기 원추형 튜브
AB15 ACCUMET Basic, Fisher Scientific13-636-AB15pH 측정기
AgaroseFisher ScientificBP1356-100아가로스 젤
황산암모늄Fisher ScientificA702-500화학
암피실린Fisher ScientificBP1760-5항생제
박테리아 인큐베이터Fisher ScientificS35836인큐베이터.
BamHINew England BiolabsR0136S제한 효소
비신Fisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 디지털 소탐지기BrasonB450세포 교란 물질
염화 세슘Fisher ScientificBP210-100화학
수산화 세Acros 유기물AC213601000화학 물질
클로람페니콜피셔 사이언티픽BP904-100항생제
디메틸 설폭사이드피셔 사이언티픽D1391화학
디티오트레이톨피셔 사이언티픽BP172-5화학
DNA 중합효소Thermo ScientificF530SHF 중합효소
dNTP 세트Invitrogen10-297-018dNTP 세트
EcoRINew England BiolabsR0101S제한 효소
에틸렌디아민테트라아세트산Fisher ScientificS311-100화학
Excella E25R 오비탈 셰이커Eppendorf New BrunswickM1353-0004오비탈 인큐베이터
GE AKTA 프라임 플러스GE 헬스케어8149-30-0004FPLC
겔 추출 키트InvitrogenK210012DNA 정제 키트
글리세롤피셔 사이언티픽G33-500화학
HindIII뉴잉글랜드 BiolabsR0104S제한 효소
His-Trap 컬럼GE HealthcareGE17-5255-015mL Histrap 컬럼
이미다졸Fisher ScientificO3196-500화학
IPTGThermo Fisher ScientificR0392유도제
KanamycinFisher ScientificBP906-5항생제
Kelvinator Series-100Kelvinator단종초저온 냉동고
LB 육수Fisher ScientificBP1426-500액체 육수
Luria Bertani 한천Fisher ScientificBP1425-2고체 육수
NaClFisher ScientificS271-500화학
NcoINew England BiolabsR0193S제한 효소
Ni-NTA 친화성 비드Thermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA 아가로스 비드
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100화학
페닐메틸설포닐 플루오라이드Fisher Scientific44-865-0화학
pyridoxal phosphateAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196크기 제외 컬럼
SacINew England BiolabsR0156S제한 효소
수산화나트륨Fisher ScientificS318-100화학
Sorvall RC-5B 원심 분리기Sorvall8327-30-1004바닥 cetrifuge
SpermineAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491크기 제외 컬럼
T4 DNA 리가제New England BiolabsM0202SDNA liagse
TrisFisher ScientificBP152-500Chemical
Ubl-specific protease 1Thermo Scientific12588018SUMO 프로테아제
, , , , , , 슘

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (1....

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PEG 8000SDS PAGE

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