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방법 논문

열린 혈관 창과 생체 내 형광 현미경을 사용한 마우스 달팽이관의 심방 혈류 측정

2.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61857

⸱

2021년 9월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

이 논문에서

요약

형광 추적자를 사용하는 개방형 혈관 창 접근 방식은 달팽이관 혈류(CoBF) 측정에 충분한 분해능을 제공합니다. 이 방법은 정상 및 병리학 적 조건에서 마우스에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화에 대한 연구를 용이하게합니다.

초록

소리의 변환은 대사적으로 까다로우며, 측벽에 있는 미세혈관구조의 정상적인 기능은 내달팽이관 전위, 이온 수송 및 체액 균형을 유지하는 데 중요합니다. 다양한 형태의 청력 장애가 달팽이관의 비정상적인 미세 순환을 수반하는 것으로 보고됩니다. 달팽이관 혈류(CoBF) 병리가 청력 기능에 미치는 영향에 대한 조사는 실현 가능한 심문 방법이 부족하고 내이에 접근하기 어렵기 때문에 어렵습니다. 형광 생체 내 현미경과 결합 된 측면 달팽이관 벽의 열린 혈관 창은 생체 내에서 CoBF 변화를 연구하는 데 사용되었지만 대부분 기니피그에서, 최근에야 마우스에서 사용되었습니다. 이 논문과 관련 비디오는 마우스 달팽이관의 혈류를 시각화하기위한 열린 혈관 창 방법을 설명합니다. 상세는 1) 마우스로부터 형광 표지된 혈구 현탁액의 제조; 2) 마취된 마우스에서 생체내 현미경 검사를 위한 개방 혈관 창의 구성, 및 3) 영상의 오프라인 기록을 이용한 혈류 속도 및 부피의 측정. 이 방법은 정상 및 병리학적 조건에서 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 조사하기 위해 마우스에서 열린 창 접근 방식을 사용하는 방법을 보여주기 위해 비디오 형식으로 제공됩니다.

서론

외측 달팽이관 벽의 미세 순환의 정상적인 기능(나선형 인대 및 선조체 혈관에 있는 모세혈관의 대부분을 구성)은청력 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다1. 비정상적인 CoBF는 소음 유발성 난청, 귀 수종 및 노안 2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 많은 내이 장애의 병태생리학과 관련이 있습니다. 생체 내 CoBF의 시각화는 청력 기능과 달팽이관 혈관 병리 사이의 연관성을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.

측두골 내 달팽이관의 복잡성과 위치로 인해 CoBF의 직접적인 시각화 및 측정이 불가능하지만 레이저 도플러 유량 측정(LDF)10,11,12, 자기 공명 영상(MRI)13, 형광 생체 내 현미경(FIVM)14, 형광 미세 내시경(FME)15, 내시경 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)16을 포함한 다양한 방법이 CoBF 평가를 위해 개발되었습니다. , 표지 된 마커 및 방사성 태그 된 마이크로 스피어를 혈류에 주입하는 접근법 (광학 미세 혈관 조영술, OMAG) 17,18,19,20. 그러나 이러한 방법 중 어느 것도 FIVM을 제외하고 생체 내 CoBF의 변화를 절대적으로 실시간으로 추적할 수 없었습니다. FIVM은 측면 달팽이관 벽의 혈관 창과 결합하여 다양한 실험실 14,21,22에 의해 다양한 실험 조건 하에서 기니피그에서 사용되고 검증 된 접근법입니다.

형광 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란을 조영제로 사용하고 형광 염료(DiO(3'-디옥타데실록사카르보시아닌 과염소산염, 녹색) 또는 딜(1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염, 빨간색)을 사용하여 마우스의 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 연구하기 위한 FIVM 방법이 성공적으로 확립되었습니다. 본 연구에서이 방법의 프로토콜은 정상 및 병리학 적 상태 (예 : 소음 노출 후)에서 마우스의 CoBF 변화를 이미징하고 정량화하기 위해 설명되었습니다. 이 기술은 연구자에게 특히 쉽게 사용할 수있는 형질 전환 마우스 모델과 함께 적용 할 때 선조체 혈관의 청력 기능 장애 및 병리와 관련된 CoBF의 기본 메커니즘을 조사하는 데 필요한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

참고: 이것은 생존이 아닌 수술입니다. 동물 사용과 관련된 모든 절차는 Oregon Health & Science University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 승인 번호 : TR01_IP00000968)에서 검토하고 승인했습니다.

1. 형광표지된 혈액세포의 제조

  1. 케타민/자일라진 마취액(5mL/kg, 재료 표 참조)을 복강내(i.p.) 주사하여 기증자 마우스(수컷 C57BL/6J ~6주 된 수컷 C5BL/J 마우스)를 마취합니다.
    알림: 이 마취 프로토콜은 매우 신뢰할 수 있으며 전신 혈압을 유지합니다.
  2. 마우스를 등 뒤로 눕히고 피부를 열고 핀셋과 해부 가위를 사용하여 흉강을 노출시킵니다. 횡격막을 자르고 클램프 가위를 사용하여 흉골 기저부를 잡고 흉곽을 자르고 들어 올려 심장을 노출시킵니다. 심장 천자로 헤파린 (15IU / mL 혈액)에 1mL의 혈액을 수집하고 4 ° C에서 3 분 동안 3,000 ×g으로 원심 분리합니다. 채혈 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
  3. 혈장을 제거하고 혈구 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL로 세척하고 3000× g 에서 4°C에서 3분 동안 3x 원심분리합니다.
  4. 혈액 세포를 PBS 중 1mL의 20mM DiO 또는 Dil로 표지하고 실온23,24에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
  5. 표지된 혈액 세포를 PBS 1mL로 원심분리 및 세척하고, 4°C에서 3분 동안 3000× g 에서 3회 원심분리하고, 주사 전에 ~0.9mL의 PBS(최종 부피 ~1.3mL)로 30% 헤마토크릿에 세포 펠릿을 재현탁합니다.

2. 열린 창을 만드는 수술 25

  1. 멸균 수술 기구와 이미징 플랫폼을 준비하고 드레이프 아래에 가열 패드를 놓습니다(그림 1A). 단계 1.1에 기재된 바와 같이 마우스(~6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스)를 마취하고, 발 반사 및 일반적인 근긴장도를 모니터링하여 마취의 깊이를 확인한다. 동물을 따뜻한 가열 패드에 놓고 직장 온도를 37 ° C로 유지하십시오.
  2. 혈압과 심장 박동을 모니터링하기 위해 CODATM 모니터 시스템에 동물 꼬리를 놓습니다 ( 재료 표 참조). 마취 상태에서 동물의 수축기 혈압, 이완기 혈압 및 평균 혈압 (MBP)을 기록합니다.
    참고: 마취된 상태와 마취되지 않은 상태에서 동물 MBP에는 차이가 없습니다(107 ± 11 mmHg 대 97 ± 7 mmHg). 동물의 심박수는 마취되지 않은 상태(357 ± 12bmp 대 709 ± 3bmp)보다 낮지만(여전히 정상 범위 내에서) 마취 상태에서 안정적입니다. 구속26에 배치 된 동물에서 약간 증가 된 심장 박동이 예상됩니다.
  3. 실체 현미경 ( 재료 표 참조)에서 측면 및 복부 접근을 통해 왼쪽 고막 수포를 열고 고막과 이소골을 그대로 둡니다21.
    1. 동물의 목 정중선을 따라 머리를 고정하고 움직임을 최소화하도록 배치하여 절개합니다(그림 1B). 이위 근육의 왼쪽 턱밑샘과 후배를 제거하고 소작하십시오.
      참고: 수술 중 통증을 줄이기 위해 부프레노르핀을 0.05mg/kg으로 피하 주사합니다.
    2. 흉쇄 유돌근과 수포를 향해 앞쪽으로 뻗어 있는 안면 신경을 식별하여 뼈 수포를 찾아 노출시킵니다.
    3. 30G 바늘로 뼈 수포를 열고 수술 용 핀셋으로 주변 뼈를 조심스럽게 제거하여 달팽이관과 등골 동맥을 명확하게 볼 수 있으며 내측 여백은 둥근 창 틈새의 가장자리에 놓여 있으며 타원형 창쪽으로 앞쪽으로 쏟아져 나옵니다 (그림 1C, D).
      알림: 기관 절개술은기도가 막히지 않도록 수행되며 수술 중 호흡기 문제가있는 경우에만 수행해야합니다. 일반적으로 마취하에있는 대부분의 동물은 호흡이 부드럽습니다. 그러나 동물이 수술 중 기관 절개술을받은 경우 기록 된 혈류를 비교에 사용해서는 안됩니다.
  4. 작은 칼날(맞춤 밀링된 #16 메스)을 사용하여 얇은 부분에 금이 갈 때까지 정점에서 약 1.25mm 떨어진 마우스 달팽이관의 정점-중간 회전에서 측벽 뼈를 긁습니다. 작은 와이어 후크로 뼈 조각을 제거합니다(그림 1E).
  5. 정상적인 생리적 조건을 유지하고 혈관 이미지 기록을 위한 광학 보기를 제공하기 위해 절단된 덮개 슬립으로 용기 창을 덮으십시오.
    참고: 모든 절차는 주의해서 수행해야 합니다. 체온을 모니터링하는 것 외에도 혈압과 심장 박동을 포함한 동물의 활력 징후도 수술 내내 모니터링해야 합니다.

3. FIVM에 따른 CoBF의 이미징

  1. 오른쪽 복재 정맥을 따라 ~1cm 절개를 하여 혈관을 노출시킵니다(그림 1F).
  2. 100μL의 FITC-덱스트란 용액(2000kDa, PBS에서 40mg/mL)과 100μL의 혈액 세포 현탁액(30% 헤마토크릿)을 복재 정맥(그림 1G)을 통해 동물에 연속적으로 주입하여 혈관을 시각화하고 혈류 속도를 추적할 수 있습니다.
  3. 주사 후 5분 후에 비디오 모니터에서 직접 실시간으로 혈류를 관찰합니다. 긴 작동 거리(W.D.) 대물렌즈(W.D. 30.5mm, 10x, 0.26 개구수)가 장착된 형광 현미경과 다중 대역 여기 필터 및 호환 가능한 방출 필터(재료 표)가 포함된 램프 하우징을 사용하여 혈관을 이미지화합니다. 고해상도 디지털 흑백 전하 결합 장치 카메라(재료 표)를 사용하여 2프레임/초로 비디오를 녹화합니다. 비디오당 350개 이상의 이미지를 수집하여 유속을 성공적으로 분석할 수 있습니다.
    알림: 나선형 인대와 선조 혈관의 혈관은 광학 초점을 조정하여 이미지화할 수 있습니다(보충 비디오 1).

4. 비디오 분석

  1. 적절한 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 용기 직경을 측정하고 획득한 이미지에서 용기를 가로지르는 두 고정 지점 사이의 거리를 결정합니다.
  2. 이미지 위치들(27) 사이의 공간적 거리 내에서 표지된 혈액 세포의 이동을 추적함으로써 캡처된 비디오 프레임들로부터 혈류 속도를 계산한다.
    1. 소프트웨어에서 혈류의 비디오를 열고 (피지 [ImageJ]가이 프로토콜에서 사용됨), 이미지의 크기를 설정하십시오.
    2. 추적 기능을 사용하여 선택한 DiO 염색 혈액 세포를 추적합니다. 유속의 자동 계산을 위해 비디오에서 셀이 이동한 거리와 이미지 프레임 사이의 시간 간격을 사용합니다.
  3. 다음 방정식에 따라 체적 유량(F)을 계산한다: F = V × A. (V: 속도; A: 선박의 단면적).

5. 소음 노출

  1. 동물을 철망 케이지에 넣습니다. 소음 노출 부스에서 120dB 음압 레벨의 광대역 소음에 3시간 동안 노출시키고 다음 날 추가로 3시간 동안 노출시킵니다.
    참고: 이 실험실에서 일상적으로 사용되는 이 소음 노출 방식은 달팽이관 감도의 영구적인 손실을 초래합니다28.

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결과

측벽에 있는 달팽이관 모세혈관의 외과적 노출 후(그림 1), 열린 혈관 창을 통해 FITC-덱스트란 표지된 혈관에서 딜 표지된 혈액 세포의 생체 내 고해상도 형광 현미경 관찰이 가능했습니다. 도 2A는 마우스 달팽이관 정점-중간 회전 측벽의 모세혈관을 보여주는 FIVM 하에서 촬영한 대표적인 이미지이다. 이 혈관의 루미나는 혈장과 혼합 된 FITC- 덱스 트란의 형광에 의해 가시화됩니다. 혈관 네트워크에 분포 된 개별적으로 표지 된 혈액 세포도이 이미지에서 명확하게 볼 수 있습니다. 두 개의 별개의 네트워크 - 나선형 인대의 모세 혈관 및 선조 혈관의 모세 혈관 -은 위치에 의해 구별된다 (직립 현미경 하에서, 선조 혈관은 나선형 인대 아래에서 광학적으로 실행되며, 더 많은 모세 혈관 루프와 더 작은 혈관(25)을 포함한다...

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토론

이 논문은 마우스 모델의 달팽이관 측벽(및 선조체 혈관)에 있는 모세혈관이 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창 준비에서 형광단 라벨링으로 시각화될 수 있는 방법을 보여줍니다. 마우스 모델은 널리 사용되고 인간의 건강 및 질병을 조사하기 위한 포유동물 모델로서 선호된다. 여기에 설명된 프로토콜은 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창을 사용하여 마우스 측벽(특히 선조체 혈관에서)에서 CoBF를 이미징하고 조사하기 위한 실현 가능한 접근 방식입니다. 이 방법은 형광 표지된 혈액 세포를 추적자로서 사용하여 혈류 속도 및 부피를 결정하기 위한 충분한 분해능을 제공합니다(그림 3 및 그림 4 ). 이러한 접근법은 혈관 투과성의 평가 및 주위세포 수축성의 검사, 및 순환 골수 세포 이동의 추적과 같은 여러 상이한 용도에 사용될 수 있다(25). 외상, 감염, 소음, 이물질, 이독성 약물 또는...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) 및 Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi)의 Medical Research Foundation의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9 % 염화나트륨HospiraNDC 0409-1966-020.6 mL (1 mL 용)
1,1 ′ -Dioctadecyl-3,3,3′ , 3′ -tetramethylindocarbocyanine perchlorateSigma Aldrich46849520 µ M
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateSigma AldrichD429220 µ M
CODA 모니터 시스템Kent scientificCODA 모니터, 혈압 및 심장 박동 모니터링용
CoverslipFisher Scientific12-542A
DC 온도 컨트롤러FHC40-90-8D
Fiji/ImageJNIH용기 직경
측정 FITC-dextran(2000kDa)Sigma AldrichFD2000s40 mg/mL
헤파린 나트륨 주입, USP MDVMylanNDC 67457-374-125000 USP 단위 / mL
카타 테시아 (100 mg / mL)Henry ScheinNDC 11695-0702-10.2 mL (1 mL 용)
현미경 대물렌즈Mitutoyo378-823-5모델 : M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER 카메라Hamamatsu모델 : C4742-80-12AG
PBSGibco2085387
Xyzaine (100 mg/ml, 5배 희석 사용)LloydLPFL048210.2 mL (1 mL용)
줌 스테레오 현미경올림푸스모델: SZ61, 형광 현미경

참고문헌

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