Method Article

High Content Imaging Analysis를 사용한 심장 재프로그래밍 평가

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고함량 이미징 분석을 사용하여 in vitro에서 직접 재프로그래밍된 유도 심근세포 유사 세포(iCM)를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 자동화된 방식으로 심장 재프로그래밍의 효율성을 정량화하고 iCM을 직접 시각화할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 목표는 재프로그래밍 기술에 의해 체외에서 직접 재프로그래밍되는 유도 심근세포 유사 세포(iCM)를 정량화하는 방법을 설명하는 것입니다. 심장 재프로그래밍은 새로운 심근세포를 생성하는 전략을 제공합니다. 섬유아세포에 핵심 심인성 전사 인자를 도입함으로써; 섬유아세포는 만능 줄기세포 상태를 거치지 않고 iCM으로 전환될 수 있습니다. 그러나 섬유아세포에서 iCM으로의 전환율은 여전히 낮습니다. 따라서 심장 재프로그래밍 효율성을 향상시키기 위한 수많은 추가 접근 방식이 있습니다. 이러한 연구의 대부분은 유세포 분석을 사용하여 심장 재프로그래밍 효율성을 평가하는 동시에 iCM을 시각화하기 위해 면역세포화학을 수행했습니다. 따라서 iCM 재프로그래밍의 성공을 입증하기 위해 적어도 두 개의 개별 재프로그래밍 실험 세트가 필요합니다. 대조적으로, 자동화된 High Content Imaging 분석은 상대적으로 적은 수의 세포로 iCM 재프로그래밍의 정량화와 적격성 평가를 모두 제공합니다. 이 방법을 사용하면 단일 재프로그래밍 실험으로 iCM의 양과 품질을 직접 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식은 재프로그래밍 효율성을 높이기 위해 유전적 또는 약리학적 요인을 스크리닝하는 것과 같은 대규모 재프로그래밍 실험이 필요한 향후 심장 재프로그래밍 연구를 촉진할 수 있습니다. 또한 High Content Imaging Analysis 프로토콜의 적용은 심장 재프로그래밍에 국한되지 않습니다. 다른 세포 계통의 재프로그래밍뿐만 아니라 면역염색된 세포의 정량화와 시각화가 모두 필요한 모든 면역염색 실험에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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심장 재프로그래밍은 새로운 심근세포를 생성하기 위한 줄기세포 매개 접근법에 대한 대안적 접근법으로 개발되었습니다. 줄기세포 상태를 통해 전이되지 않는다는 점을 감안할 때, 줄기세포 매개 접근법에서 일부 유전적 한계를 우회할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 섬유아세포에 적어도 3개 또는 4개의 심인성 전사 인자의 바이러스 감염은 섬유아세포 유전자 프로그램을 제거하고 섬유아세포에서 심인성 전사 네트워크를 재건함으로써 섬유아세포를 심장 운명으로 전환할 수 있는 것으로 나타났습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,

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Protocol

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모든 동물 시술은 밴더빌트 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 레트로바이러스 생성 및 체외 심장 재프로그래밍

  1. 백금 E 세포 포화도가 70%–80%에 도달할 때까지 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1μg/mL 퓨로마이신 및 10μg/mL 블라스티시딘을 보충한 DMEM에서 백금 E 세포를 배양합니다.
  2. 1일차에 ~0.55 x 106 세포(첫 번째 웰) 및 ~0.18 x 106 세포(두 번째 웰)를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 1mL의 DMEM이 함유된 12웰 플레이트의 별도 웰 2개에 첫 번째 트랜스펙션 하루 전에 시딩합니다.
    참고: 실험에 필요한 바이러스 배지의 양에 따라 다양한 크기의 배양 접시를 사용할 수 있습니다. 다른 실험 규모에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
  3. 2일차에 이전 연구9 에서 설명한 Mef2c, Gata4, Tbx5 및 Hand2를 인코딩하는 쿼드-시스트로닉 M-G-T-H 레트로바이러스 구조체를 형질주입하....

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Results

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재프로그래밍 실험에 이어 위에서 설명한 대로 고함량 이미징 분석을 사용하여 iCM을 정량화했습니다. High Content 이미징 분석에 사용된 36개 이미징 부위의 복합 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. iCM은 이러한 실험에서 이중 양성 세포(α-actinin+Titin-eGFP+)로 정의됩니다. High Content Imaging 분석에 따르면 M-G-T-H 형질도입 후 세포의 ~26%가 두 심장 마커를 모두 나타낸 반면, 빈 벡터 형질도입 대조군 세포의 ~1%는 이중 양성 세포를 나타냅니다. 개별 iCM은 High Content Imaging System으로 촬영한 10x 이미지로 시각화되었습니다(그림 2).

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Discussion

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이전의 리프로그래밍(reprogramming) 연구에서는 유세포분석을 사용하여 리프로그래밍(reprogramming) 효율을 평가하고 두 개의 별도 실험에서 면역세포화학(immunocytochemistry)을 사용하여 iCM의 구조적 품질을 입증했습니다. 유세포 분석에는 훨씬 더 많은 수의 시작 세포가 필요하므로 실험 규모가 커집니다. 대조적으로, High Content Imaging 분석은 상대적으로 적은 수의 세포를 사용한 단일 실험으로 iCM 재프로그래밍의 품질과 양을 모두 평가할 수 있습니다. 따라서 이 새로운 방법은 향후 재프로그래밍 연구를 위한 효율적인 새로운 기술 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 특히, 이 새로운 방법은 새로운 유전적 또는 약리학적 요인을 스크리닝하기 위한 재프로그래밍 실험에 유용할 것입니다. 많은 수의 요인을 테스트하기 위해 분석 형식을 384웰 형식으로 축소할 수 있습니다.

변환 효율성은 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High Content Imaging 분석은 David Westover와 Joshua Bauer의 도움을 받아 Vanderbilt HTS(High-Throughput Screening) 핵심 시설에서 수행되었습니다. HTS Core는 Vanderbilt Institute of Chemical Biology 및 Vanderbilt Ingram Cancer Center(P30 CA68485)의 지원을 받습니다. 이 연구는 AHA Innovative Project Award 18IPA34110341 및 NIH R01 HL146524(Y-.J. N.), AHA 박사 후 펠로우십 상 20POST35210170(Z.Z)의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
안티 치킨 Alexa 488ThermofisherA11039
안티 GFP 항체InvitrogenA10262
안티 마우스 Alexa 555ThermofisherA21422
안티 & 알파;-액티닌 항체SigmaA7811
DAPI 솔루션Vector labsH1200
Fugene 6PromegaE2691
인슐린-트랜스페린-셀레늄G 보충제Invitrogen41400-045
매체 199Invitrogen11150059
MEM 비타민 용액Invitrogen11120-052
MetaXpress 소프트웨어분자 장치
Micro XL 자동 세포 상상 시스템분자 장치
최소 필수 아미노산 용액SigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
PES 필터 (0.45 µ m)Thomas scientific1159T84
Platninum E 세포Cell BiolabsRV-101
폴리브레네시그마H9268
SB431542시그마S4317
범용 차단 버퍼BiogeneXHK083-50K

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature.....

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Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
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