우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
후각 내시경 신경교 (OEG) 세포는 후각 점막에서 후각 전구의 후각 신경 층 (ONL)으로 모든 방법을 국소화된다. 성인 생활 내내, 그들은 새로 생성 된 후각 뉴런의 축 하 성장에 대 한 열쇠, 라미나 프로 프리 테리토리에서 ONL. 그들의 프로 재생 속성으로 인해, 이 세포는 척수 또는 시신경 상해 모형에 있는 축축재생을 육성하기 위하여 이용되었습니다.
우리는 신경 손상 후 OEG 신경 재생 용량을 분석하고 측정하기 위해 체외 모델을 제시합니다. 본 모델에서, 가역적으로 불멸의 인간 OEG(ihOEG)는 단층으로 배양되고, 망막은 성인 쥐로부터 추출되고 망막 신경절 뉴런(RGN)은 OEG 단층상에 공동 배양된다. 96h 후, RGNs의 축산 및 소종 절인 마커는 축축및 평균 축산 길이/뉴런을 가진 RG의 수에 의해 정량화된다.
이 프로토콜은 배아 또는 산후 뉴런에 의존하는 다른 체외 분석에 비해 장점이 있으며 성인 조직에서 OEG 신경 재생 특성을 평가합니다. 또한 ihOEG의 신경 재생 잠재력을 평가하는 데 유용할 뿐만 아니라 OEG 또는 다른 신경교 세포의 다른 소스로 확장 될 수 있습니다.
서론
성인 중추 신경계 (CNS) 뉴런은 부상이나 질병 후 재생 능력이 제한되어 있습니다. CNS 재생을 촉진하는 일반적인 전략은 줄기 세포, 슈완 세포, 성상세포 또는 후각 내성 신경교(OEG) 세포1,2,3,4,5와같은 축축성장을 유도하는 세포 유형의 부상부위에서이식된다.
OEG는 신경 문장6에서 파생되고 후각 점막과 후각 전구에서 찾습니다. 성인에서, 후각 감각 뉴런은 환경 노출의 결과로 정기적으로 죽고 새로 분화 된 뉴런으로 대체됩니다. OEG는 이러한 새로운 후각 축축을 둘러싸고 안내하여 후각 전구에 들어가 CNS7에서목표를 가진 새로운 시냅스를확립합니다. 이러한 생리적 특성으로 인해 OEG는 척수 나 시신경 손상과 같은 CNS 부상 의 모델에 사용되어 왔으며 신경 생성 및 신경 보호 특성은8,
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 동물 실험은 국가 및 기관 생물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. ihOEG (Ts12 및 Ts14) 문화
참고: 이 절차는 조직 배양 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행됩니다.
- 표 1에제공된 50mL ME10 OEG 배양 배지를 준비한다.
- 표 1에제공된 대로 DMEM/F12-FBS 5mL을 15mL 원문 튜브에 준비합니다.
- 깨끗한 수조에서 37°C에서 두 미디어를 15분 동안 데우습니다.
- 깨끗한 수조에서 Ts12 및 Ts14 세포바이알을 37°C에서 해동합니다.
- 2단계에서 제조된 DMEM/F12-FBS 배양 배지에 세포를 다시 일시 중지하고 추가합니다.
- 200 x g에서5 분 동안 원심 분리기.
- 상체를 갈망합니다.
- ME10 배지 의 500 μL을 추가하고 펠릿을 다시 중단합니다.
- ME10의 3mL로 p60 세포 배양 접시를 준비하고 셀룰러 서스펜션을 드롭 와이즈로 추가합니다.
- 플레이트 에 걸쳐 균일하게 세포를 배포하려면 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 프로토콜에서, 우리는 신경 손상 후 OEG 신경 재생 용량을 분석하는 체외 모델을 제시한다. 도 1에도시된 바와 같이, OEG 소스는 부검15,17,18에서얻은 후각 전구로부터 제조된 1차 배양으로부터 유래한 가역불멸인간 OEG 클론 세포주-Ts12-이다. 망막 조직은 성인 쥐로부터 추출되고, 소화되고, 망막 신경절 뉴런(RGN) 현탁액은 PLL 처리커버립 또는 ihOEG 단층층, Ts14 또는 Ts12에 도금된다. 축 산 및 소종 호르몬 성 마커는 면역 형광및 축산 재생에 의해 정량화된다.
Ts14 OEG 정체성은 S100β(도 2A)및 바이멘틴(도
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
CNS 상해 부위에서 OEG 이식은 구성적인 프로 신경 재생특성7,8,9로인해 CNS 부상에 대한 유망한 치료법으로 간주됩니다. 그러나, 조직원에 따라 후각점막(OM-OEG)과 후각전(OB-OEG)-또는 기증자의 나이에 따라, 이러한 용량26,31,33,36에상당한 변화가 존재한다. 따라서 생체 내 연구를 시작하기 전에 주어진 OEG 샘플의 신경 재생 용량을 분석하기 위해 시험관 모델에서 쉽고 재현 가능한 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 성인 쥐의 축축화 된 RGN은 분석하기 위하여 OEG의 단층상에 교배됩니다. 면역 형광에 의한 R.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 프로젝트 SAF2017-82736-C2-1-R 장관 드 시엔시아 e 이노바시온에서 MTM-F, Fundación Universidad Francisco de Vitoria에서 JS에 의해 재정적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항체 514 | Reference 34 | MAP2A 및 B를 인식하는 Rabbit polyclonal antiserum. | |
| 항체 SMI-31 | BioLegend | 801601 | MAP1B 및 NF-H 단백질에 대한 단클론 항체 |
| 안티 마우스 Alexa Fluor 488 항체 | ThermoFisher | A-21202 | |
| 안티 토끼 Alexa Fluor 594 항체 | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 보충제 | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA 수용체 억제제 |
| DAPI | Sigma | D9542 | 핵 형광 염색 |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | 세포 배양 배지 |
| FBS | Gibco 11573397 | 소 태아 혈청 | |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | 소 태아 혈청 |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | 장착 매체 |
| ImageJ | National Institutes of Health(NIH-USA) | 이미지 소프트웨어 | |
| L-글루타민 | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | 신경 세포 배양 배지 |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | 신경 세포 분리에 사용하기 위해 |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B | Lonza | 17-745E | 정균 및 살균 |
| 뇌하수체 추출물 | Gibco | 13028014 | 소 뇌하수체 추출물 |
| 폴리-L- 라이신(PLL) | Sigma | A-003-M |
참고문헌
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
