자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.
방법 논문
자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.
지질 대사는 세포 와 유기체 건강에 필요한 기본적인 생리 과정입니다. 지질 대사의 dysregulation는 수시로 심장 혈관 무질서, 타입 II 당뇨병 및 암을 포함하여 비만 및 많은 관련질병을 유도합니다. 지질 대사 조절의 현재 이해를 증진하기 위해, 시간과 공간에서 생체 지질 저장 수준을 정확하게 측정하는 정량적 방법은 점점 더 중요하고 유용해지고 있다. 지질 저장을 분석하는 전통적인 접근 방식은 현미경 평가를 위한 반정성 또는 생화학적 측정을 위한 spatio-측두성 정보 부족입니다. 자극된 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 세포 외 분해능을 가진 살아있는 세포에서 지질을 신속하고 정량적 검출할 수 있는 라벨이 없는 화학 영상 기술입니다. 본질적인 분자 진동에서 대조가 악용됨에 따라 SRS 현미경 검사법은 살아있는 동물의 지질을 4차원 추적할 수 있습니다. 지난 10년 동안, SRS 현미경 검사는 생체 의학 연구에서 작은 분자 이미징에 널리 사용되었으며 기존의 형광 염색 및 지질 추출 방법의 주요 한계를 극복했습니다. 실험실에서, 우리는 강력한 모형 유기체, Caenorhabditis elegans에 유효한 유전 및 생화학 공구와 SRS 현미경 검사를 결합했습니다, 다른 세포및 조직에 걸쳐 지질 물방울의 분포 그리고 이질성을 조사하고 궁극적으로 지질 대사를 조절하는 새로운 보존된 신호 통로를 발견하기 위하여. 여기서, 우리는 SRS 현미경의 작업 원리및 상세한 설정을 제시하고 야생 형 및 인슐린 신호 결핍 돌연변이 C. elegans의뚜렷한 발달 시점에서 지질 저장을 정량화하는 데 사용하는 방법을 제공합니다.
비만은 전 세계 인구의 3분의 1을 위협하는 글로벌 건강 문제가 되었으며, 당뇨병 2, 심혈관 질환3 및 일부 유형의암4를포함한 정신 건강1 및 치명적인 질병과의 연관성을 감안할 때 심각한 의학적 우려를 제시하고 있다. 지질 대사의 연구는 비만 뒤에 생물학 문제를 더 잘 이해하기 위하여 필수적입니다. 지질 저장의 신속하고 구체적인 정량화는 지방산및 그 유도체의 검출뿐만 아니라 스테롤 함유 대사산물의 검출을 수반하며, 높은 감도와 바람직하게는 공간 정보로 수반된다. 지질은 본질적인 형광이 부족하고 쉽게 형광 태그가 될 수 없기 때문에 이미지에 도전적인 표적입니다. 형광 태그는 종종 지질 분자보다 더 크므로 생체 응용 분야에서 화학적으로 침습적이고 비실용적 일 수 있습니다. 지질 분자의 소수성 구조를 보존하기 위해서는 라벨이 없거나 최소한의 라벨링 전략이 필요하다5. 이미징 기술의 최근 발전은 살아있는 세포, 조직 및 유기체에 있는 지질의 레이블 없는 화상 진찰을 위한 흥미진진한 기회를 만들었습니다.
생물학적 샘플에서 지질 저장 분석을....
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1. 자극 라만 산란 현미경 검사법에 대한 악기 설정
참고: SRS 현미경 시스템은 펌프 통합 광학 파라메트릭 발진기와 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 피코초 레이저를 기반으로 구축됩니다. 발진기는 1,064 nm의 스토크스 빔과 700-990 nm 사이의 펌프 빔을 포함하여 두 개의 피코초 펄스 트레인을 제공합니다. 두 빔의 시간적 및 공간 중첩은 레이저 내부에서 달성된다. 내장된 전자 광학 변조기(EOM)는 SRS 현미경 검사를 위해 특별히 설계되었습니다. 이 프로토콜은 레이저를 현미경과 결합하는 데 초점을 맞추고 이 시스템의 일상적인작동(도 1). SRS 현미경 시스템의 구성은 지난 10 년 동안 진화하고 있습니다. 다음 설명은 여러 구성 중 하나만 나타낸다는 점에 유의해야 합니다.
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인슐린 신호는 발달, 재생산, 수명 및 신진 대사에 영향을 미치는 중요한 내분비 통로입니다. 웜에서, 인슐린 신호는 약 40인슐린 같은 펩티드 리간드, 인슐린 과 같은 성장 인자 수용체 정형돌로그 DAF-2, 다운스트림 PI3K/AKT 키나아제 캐스케이드, 및 FoxO 전사 인자 직교인, DAF-1620으로구성된다. daf-2 돌연변이체는 인슐린 수용체가 결여되어 장내 지질 방울이 더 많고, 벌레 지질 저장조직(21,22)이있다. SRS 현미경 검사를 사용하여, 우리는 성인기 도중 나이 동기화된 야생 형 벌레 및 daf-2 돌연변이에 있는 장 지질 수준을 정량화했습니다. 이전 결과와 일치, 우리는 daf-2 돌연변이가 더 높은 지질 수준을 가지고 있음을 발견23,
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비만과 그 관련 신진 대사 무질서에 대하여 방어에서, 지질 항상성의 규정 기계장치를 더 잘 이해하기 위하여 중요한 연구 노력이 실행되었습니다. 생물학적 샘플에서 지질 분자의 정량적 검출을 위해 SRS 현미경 검사법에 의한 라벨 없는 이미징은 생화학 적 분석 및 기타 염색 방법에 대한 신뢰할 수있는 대안으로 입증되었습니다. 우리 그룹 및 다른 사람들은 C. elegans 및 SRS 현미경검사12,18, 28,29,30,31의사용을 결합하여 지질 대사 조절에 새로운 생물학적메커니즘을공개했다. 이 프로토콜에서, SRS 현미경 검사를 사용하여 우리는 벌레에 있는 인슐린 .......
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저자는 공개 할 것이 없습니다.
이 작품은 NIH 보조금 R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W에 의해 지원되었다.), DP1DK113644 (M.C.W.), 디임스 재단 (M.C.W.), 웰치 재단 (M.C.W.), HHMI 조사관 (M.C.W.). 우리는 C. elegans 균주에 대한 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A/D 컨버터 | 올림푸스 | 아날로그 유닛 | |
| Agarose | GeneMate | 3119 | 아가로스 패드 제작용 |
| 정렬 도구 - 어댑터 | Thorlabs | SM1A4 | 스코프에 도구 장착용 |
| 정렬 도구 - 대상 | Thorlabs | VRC2SM1 | IR 레이저 정렬 도구 보기용 |
| - 튜브 | Thorlabs | SM1L40 | 길이 캔 |
| 가변 자동 상관기(옵션) | APE | pulseCheck | |
| 대역통과 필터 | 미니회로 | BBP-21.4+(20MHz로 변조된 경우) 또는 KR Electronics 2724(8MHz로 변조된 경우 | 변조 주파수 필터링 신호용 |
| BNC 케이블 | |||
| 해부 현미경 | Nikon | SMZ800 | 이미징 |
| 용 웜 취급 및 피킹용Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | SRS 신호 보정에 사용 |
| 필터 | 크로마 기술 | 890/220 CARS | 스톡스 빔 제거용 |
| 범용 실험실 라벨링 테이프 | VWR | 89097 | 아가로스 패드 제작용 |
| 유리 커버슬립 | VWR | 48393-106 | 이미징용 웜 커버 |
| 유리 현미경 슬라이드 | VWR | 16004-422 | 아가로스 패드 제작용 |
| 레이저 스캐닝 현미경 | 올림푸스 | FV3000 | |
| 렌즈 | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B | 빔 익스팬더용 |
| 락인앰플리파이어 | 취리히 | HF2LI | |
| 저역 통과 필터 | 미니회로 | BLP-1.9+ | 전원 공급 장치 노이즈 억제 |
| 미러용 | 릴레이 | 및 잠망경용 | BB1-E03 |
| 대물 | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
| 포토다이오드 | Thorlabs | FDS1010 | |
| 피코초 레이저 소스 | APE | 피코에메랄드 | |
| 전원 공급 장치 | TEKPOWER | TP1342U | 포토다이오드용, 역방향 50V 전압 |
| 아지드나트륨 | 시그마 | S2002 | 웜 |
| 웜 피커 | WormStuff | 59-AWP |
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