우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.
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이 논문에서
요약
초록
클론 조혈은 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)에서 체세포 돌연변이의 축적에서 유래 널리 퍼지는 연령 관련 상태입니다. 드라이버 유전자에 있는 돌연변이, 그 세포 적합성을 부여하는, 점점 체세포 돌연변이를 품고 자손 백혈구를 초래하는 HSPC 클론확장의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 클로날 조혈은 심장 질환, 뇌졸중 및 사망률과 관련이 있기 때문에 이러한 프로세스를 모델링하는 실험 시스템의 개발은 이 새로운 위험 요소의 밑에 있는 메커니즘을 이해하는 데 핵심적입니다. 총 신체 조사 (TBI)와 같은 마우스에서 골수 이식 과 관련된 골수 이식 절차는 일반적으로 심혈관 질환에서 면역 세포의 역할을 연구하기 위해 사용됩니다. 그러나, 골수 틈새 시장 및 관심의 다른 사이트에 동시 손상, 심장과 두뇌 등, 이러한 절차와 피할 수. 따라서, 우리의 실험실은 TBI에 기인한 가능한 부작용을 최소화하거나 피하기 위하여 2개의 다른 방법을 개발했습니다: 1) 조사 차폐를 가진 골수 이식 및 2) 비 조건화 마우스에 입양 BMT. 보호 된 기관에서, 지역 환경은 상주 면역 세포의 기능이 흔들리지 않는 동안 클로날 혈종의 분석을 허용 보존된다. 대조적으로, 비조건 마우스에 대한 채택 BMT는 장기와 조혈 틈새 시장이 모두 보존된다는 추가적인 이점이 있다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 조혈 세포 재구성 접근을 비교하고 심장 혈관 질병에 있는 클론 조혈의 연구 결과를 위한 그들의 강점 그리고 한계를 토론합니다.
서론
클로날 조혈(CH)은 노인 개인에서 자주 관찰되는 상태이며,유전돌연변이를운반하는 확장된 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC) 클론의 결과로 발생한다. 그것은 50의 나이에 의해, 대부분의 개별은 각 HSPC2에있는 5개의 엑소닉 돌연변이의 평균을 취득할 것이라는 점을 건의되었습니다, 그러나 이 돌연변이의 대부분은 개별에 거의 또는 전혀 현상상 결과를 초래할 것입니다. 그러나, 우연히 이러한 돌연변이 중 하나가 HSPC에 경쟁 우위를 부여하는 경우-이러한 확산을 촉진 하 여, 자기 갱신, 생존, 또는 이들의 일부 조합-이 다른 HSPC에 비해 돌연변이 클론의 우대 확장으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, 돌연변이는 돌연변이된 HSPC가 성숙한 혈액 세포를 초래하기 때문에 조혈 계통을 통해 점점 더 퍼질 것이고, 말초 혈액 내의 돌연변이 된 세포의 뚜렷한 인구로 이끌어 냅니다. 수십 개의 상이한 후보 운전자 유전자에서 돌연변이가 조혈 시스템 내의 클로날 이벤트와 연관되어 있지만, 이들 중 DNA 메틸트랜스퍼라제 3알파(DNMT3A)와1011개의 전좌2(TET2)의돌연변이가 가장 널리 퍼진3이다. 몇몇 역학 연구는 이 유전 돌연변이를 전송하는....
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프로토콜
동물 과목과 관련된 모든 절차는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 사전 조정 하기 전에
- 수신자 마우스를 항생제 보충 수역(5m 설페스토사졸, 0.86 mM trimethoprim)에 배치하여 조사 전에 ~24시간. 이것은 감염을 방지하기 위하여 필요합니다, 면역 계통은 조사 다음 억압될 것이고, 조사 다음 2 주 동안 유지될 것이기 때문에. 이 시점에서, 먹이 를 장려 하 고 조사 후 체중 감량과 탈수 방지 하기 위해 영양/수분 젤으로 마우스를 보충.
그림 1: 다양한 사전 컨디셔닝 설정을 보여주는 이미지입니다. (A)감마선(Cesium-137)을 이용한 파이케이지 총 신체 조사 설정): 방사선 빔은 y축 방향(수평 방사선)에서 조사자의 뒤쪽에서 나온다. (B)
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결과
기증자 세포 이식에 대한 3개의 BMT/사전 컨디셔닝 방법의 효력을 비교하기 위하여는, 말초 혈액 및 심장 조직에 있는 기증자 세포의 분획은 BMT 후 1 달에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었습니다. 분리된 세포는 백혈구의 상이한 하위 집합을 확인하기 위해 특정 백혈구 마커를 위해 염색하였다. 이러한 실험에서,야생형(WT) C57BL/6(CD45.2) 기증자 골수 세포는 WT B6로 전달되었다. SJL-Ptprc는 수신자의세포로부터 기증자 세포를 구별하기 위해 Prpcb/BoyJ(CD45.1) 받는 마우스를 구별한다. 사용된 유동 세포측정제 게이팅 전략은 이전에 왕외9에 의해 설명되어 있다.
총 신체 조사(TBI) 처리군은 총 치명적인 방사선량 11Gy의 총 치명적인 방사선.......
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토론
클로날 조혈의 연구를 위해, 우리는 BMT의 세 가지 방법을 설명: 총 몸 조사와 BMT, 부분 차폐와 조사와 BMT, 그리고 더 사전 컨디셔닝을 포함 덜 일반적으로 사용되는 BMT 방법 (입양 BMT). 이 방법은 심혈관 질병에 대한 클로날 혈토포이의 영향을 평가하기 위해 사용되었습니다. 연구원은 그들의 연구 결과의 특정 목적에 맞게 이 방법을 그에 따라 수정할 수 있습니다.
클로날 조혈 모델
클로날 조혈은 돌연변이 조혈 세포가 야생 형 세포와 경쟁하고 시간이 지남에 따라 복제 우세를 얻는 현상입니다. 이 경쟁의 모형을 만들기 위하여는, 마우스는 유전적으로 다른 세포의 혼합물로 구성된 골수를 관리될 수 있습니다. 일반적으로, 이 혼합물은 형광 태그 또는 다른 범류 세포 마커 (즉, CD45.1 및 CD45.2)로 표지된 돌연변이 및 야생 형 세포를 포함할 것이다. 예를 들어 Tet2-매개CH를 모방한 모델을 만들 때, 우리는 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 K. 월시 (HL131006, HL138014 및 HL132564), S. 사노 (HL152174), M. A. 에반스 (20POST35210098) 및 일본 심장 재단에 대한 미국 심장 보조금에 대한 미국 국립 보건 원에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5ml 마이크로 원심분리기 | Fisher Scientific | 05-408-121 | 일반 공급 |
| 1.5ml 마이크로 원심분리기 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 일반 공급 |
| 1/2cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | 일반 공급 |
| Absolute Ethanol (200 prfof) | Fisher chemical | 200559 | 일반 공급 |
| BD 1mL 투베르쿨린 주사기 25G 5/8 인치 바늘 | Becton Dickinson | 309626 | 일반 공급 |
| BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm) | Becton Dickinson | 395195 | 일반 공급 |
| Cesium-137 Irradiator | J. L. Shepherd | Mark IV | 장비 |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | 일반 공급 |
| Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시 | 생명 과학 | 353003 | 일반 공급 |
| Falcon 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브 | Fisher Scientific | 352098 | 일반 공급 |
| Fisherbrand 멸균 세포 여과기, 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | 일반 공급 |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | 일반 공급 |
| 경화 정밀 가위 | Fine Science Tools | 14090-09 | 일반 공급 |
| Isothesia (Isoflurane) 용액 | Henry Schein | 29404 | 용액 |
| Ketamine Zoetis | 043-304 | 주입 | |
| Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼 | Kimtech Science | KCC34155 | 일반 공급 |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | 솔루션 |
| RadDisk – 설치류 조사기 디스크 | Braintree Scientific | IRD-P M | 일반 공급 |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole 및 Trimethoprim | TEVA | 0703-9526-01 | 주입 |
| Xylazine | Akorn | 139-236 | 주입 |
| X선 조사기 | Rad source | RS-2000 | 장비 |
참고문헌
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.....
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재인쇄 및 허가
