이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.
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방법 논문
RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리
이 논문에서
요약
초록
내장 지방 조직(VAT)은 주로 성숙한 지방 세포와 기질 혈관 분획(SVF) 세포로 구성된 활성 대사 기관으로, 대사, 호르몬 및 면역 과정을 조절하는 다양한 생체 활성 분자를 방출합니다. 현재로서는 이러한 과정이 지방 조직 내에서 어떻게 조절되는지는 불분명합니다. 따라서 지방 조직의 병태생리학에 대한 각 세포 집단의 기여도를 평가하는 방법의 개발이 중요합니다. 이 프로토콜은 분리 단계를 설명하고 콜라겐분해효소 효소 분해 기술을 사용하여 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포 및 SVF를 효율적으로 분리하는 데 필요한 문제 해결 지침을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 대식세포 서브세트를 식별하고 유전자 발현 연구를 위한 성숙한 지방 세포 RNA 분리를 수행하도록 최적화되어 있어 이러한 세포 집단 간의 상호 작용을 해부하는 연구를 수행할 수 있습니다. 간단히 말해서, VAT 생검은 세척하고, 기계적으로 다지고, 소화되어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 원심분리 후, 성숙한 지방세포는 SVF 펠릿에서 부유선광에 의해 분리됩니다. RNA 추출 프로토콜은 다운스트림 발현 분석을 위해 지방세포에서 총 RNA(miRNA 포함)의 높은 수율을 보장합니다. 동시에 SVF 세포는 유세포 분석을 통해 대식세포 하위 집합(전염증 및 항염증 표현형)을 특성화하는 데 사용됩니다.
서론
백색 지방 조직은 지방 세포 또는 지방 세포뿐만 아니라 대식세포, 조절 T 세포(Tregs)와 같은 기타 면역 세포, 호산구, 지방세포, 섬유아세포로 구성된 이질적인 세포 집단을 포함하는 기질 혈관 분획(SVF)으로 알려진 비지방 세포 분획으로 구성되어 있으며 혈관 및 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다 1,2. 지방 조직(AT)은 이제 다른 세포에서 생성되어 조직으로 방출되는 아디포카인, 사이토카인 및 마이크로RNA를 통해 대사 및 염증과 관련된 생리적 과정을 조절하는 기관으로 간주되며 자가분비, 파라크린 및 내분비 효과 3,4. 인간의 경우 백색 지방 조직은 피하 지방 조직(SAT)과 내장 지방 조직(VAT)으로 구성되며 중요한 해부학적, 분자적, 세포적, 생리학적 차이가 있습니다 2,5. SAT는 인간 AT의 최대 80%를 차지하는 반면, VAT는 주로 장간막과 난막에 있는 복강 내에 위치하며 신진대사가 더 활발하다6. 또한 VAT는 체....
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프로토콜
이 프로토콜은 Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15)의 IRB에 의해 승인되었습니다. 참여는 자발적이었으며, 등록된 모든 여성들은 정보에 입각한 동의서에 서명했다.
1. 내장 지방 조직 수집
- 분만 없이 단태 임신을 한 건강한 성인 여성의 제왕절개 중 부분 자궁 절제술을 통해 VAT 생검을 받습니다.
- 자궁을 폐쇄하고 지혈을 한 후, 더 큰 오멘텀을 확인하고 습식 찜질로 확장합니다. 노출된 AT는 VAT입니다.
- 가장 큰 혈관을 찾아 7 x 5cm의 가상의 선을 따라 더 큰 오멘텀 기저부까지 이동합니다.
- 혈관 구역을 식별하고 Kelly 겸자를 사용하여 VAT의 바깥쪽을 뚫습니다.
- Ochsner 집게를 사용하여 VAT가 뚫린 영역에서 근위부 및 원위부를 고정하고 Metzenbaum 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
- 블랙 실크 넘버 1로 더 큰 오멘텀을 묶습니다.
- Ochsner 겸자를 제거하고 지혈을 평가합니다.
- VAT 생검을 멸균 용기에 넣고 즉시 실험실로 운반합니다.
2. 내장 지....
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결과
이 프로토콜은 부분 자궁 절제술 후 건강한 임산부로부터 얻은 VAT 생검에서 단일 공정으로 생존 가능한 성숙 지방 세포 및 SVF 세포를 분리하기 위해 콜라겐분해효소 분해 후 차등 원심분리를 사용하는 효소 방법을 설명합니다. 이 경우 RNA 추출을 위해 지방세포를 사용하고 대식세포 표현형을 위해 SVF를 사용합니다.
RNA 추출 프로토콜을 통해 적절한 순도의 RNA와 성숙한 지방 세포에서 microRNA를 얻을 수 있습니다(그림 1). RNA 품질 관리 분석기로 평가한 RNA 무결성은 프로토콜(RIN = 9.7)로 분리한 지방 세포 샘플에 대해 우수한 값을 나타냈습니다.
VAT-SVF에 존재하는 유핵 세포의 총계는 약 2.8 x 106 cells/g의 VAT (2.8 x 106 ± 1.7 x 106)였으며, 트리판 블루.......
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토론
VAT는 신진대사 조절과 염증에 중요한 역할을 합니다. 비만과 관련된 만성 염증에서 지방 세포와 면역 세포의 역할에 대한 관심이 증가함에 따라 AT에 존재하는 SVF와 지방 세포를 분리하는 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 대부분의 기술에서는 단일 절차로 동일한 VAT 생검에서 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 이 두 가지 다른 세포 세트를 얻을 수 없으며, 이는 지방 세포와 SVF 세포 간의 상호 작용에 관한 연구에 중요할 수 있습니다. 따라서 VAT 생검에 존재하는 생존 가능한 성숙 지방 세포와 SVF 세포를 분리하기 위한 자세한 설명을 제공하는 이 프로토콜을 구현했습니다. 조직 소화 및 콜라겐분해효소 농도 시간뿐만 아니라 세포 분리를 위한 원심분리 시간 및 속도에서 이전 보고서와 다르기 때문에 적절한 지방 세포 RNA 수율과 상세한 대식세포 하위 집합 특성 분석이 가능합니다.
AT 유래 세포에 대한 많은 양의 효소 및 비효소적 분리 기술이 제안되어 왔으며, 분리된 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 Instituto Nacional de Perinatologia(보조금 번호: 3300-11402-01-575-17 및 212250-3210-21002-06-15) 및 CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social(FOSISS)(보조금 번호 2015-3-2-61661)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR 튜브 | , Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free 및 비발열성 |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 | , Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free 및 비발열성 |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | Corning | CLS4101-50EA | 개별 플라스틱 포장 |
| 10 µ L 범용 피펫 팁 | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase 무료 및 비발열성 |
| 10 &마이크로; L 범용 피펫 팁 | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase 무료 및 비발열성 |
| 1000 µ L 범용 피펫 팁 | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase 무료 및 비발열성 |
| 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free 및 nonpyrogenic |
| 200 µ L 유니버설 피펫 팁 | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase 무료 및 비발열성 |
| 2100 바이오분석기 기기 | Agilent | ||
| G2939BA-2101 바이오분석기 PC | Agilent | G2953CA | 2100 전문가 소프트웨어가 PC에 사전 설치되어 |
| 5 ml 라운드 바텀 폴리스티렌 시험관 | Corning | 352003 | 스냅 캡, 멸균 |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, 원뿔형 바닥 및 멸균 |
| 산-구아니디늄-페놀 기반 시약 | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI 시약 또는 유사한 |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511-Agilent | |
| Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548-APC | |
| /Cy7 anti-human CD14 항체 | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 세포, 단핵구/대식세포에 존재, 클론 HCD14 |
| 베이커 | - | - | 250 ml, 비멸균 |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A3912-100G | 열충격 분율, pH 5.2, ≥ 96 % |
| 칩 프라이밍 스테이션 | Agilent | 5065-9951-Collagenase | |
| type II | Gibco | 17101-015 | 분말 |
| D-(+) - 포도 | Sigma-Aldrich | G8270-100G | 분말 |
| 직접 졸 RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | 50 mL TRI reagen |
| 해부 겸자 | - | 강철, 톱니 모양의 턱 및 원형 끝 | |
| 해부 트레이 | - | - | 스테인레스 스틸 |
| 에틸 알코올 | 시그마-알드리치 | E7023-500ML | 200 증거, 분자 생물학 용 |
| FACS 유동 시체 유체 | BD Biosciences | 342003-FACS | |
| 용해 용액 | BD Biosciences | ||
| 349202-FACSAria III 유세포 분석기 / 세포 분류기 | BD Biosciences | ||
| 648282-FASCDiva 소프트웨어 | BD Biosciences | 642868 | 소프트웨어 v6.0 사전 설치된 |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA- | |
| 수동 세포 카운터 | - | - | |
| Mayo 해부 가위 | - | - | 스테인리스 스틸 |
| 마이크로 원심분리기 | - | - | 온도 조절 가능한 |
| 나노드롭 분광 광도계 | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP-Orbital | |
| Shaker | - | - | 온도 및 속도 조절 가능 |
| P10 가변 볼륨 마이크로피펫 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μ L |
| P1000 가변 볼륨 마이크로피펫 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μ L |
| P2 가변 볼륨 마이크로피펫 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μ L |
| P200 가변 볼륨 마이크로피펫 | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μ L |
| PCR 튜브 보관 랙 | Axygen | R96PCRFSP-PE | |
| /Cy5 항인간 HLA-DR 항체 | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 세포, 대식세포에 존재, 클론 L243 |
| PE/Cy7 항인간 CD45 항체 | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 세포, 백혈구에 존재, 클론 H130 |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | 분말, pH 7.4, 1 L 용액 준비용 |
| 피펫 컨트롤러 | - | - | |
| 적혈구 용해 버퍼 | Roche | 11 814 389 001 | 인간 전혈에서 적혈구의 우선적 용해를 위한 |
| 냉장 원심분리기 | - | - | 50 mL 원뿔형 튜브용 Whit 어댑터 |
| 멸균 표본 용기 | - | - | - |
| 트랜스퍼 피펫 | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | 멸균 |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% 용액 |
| 튜브 랙- | - | 다양한 튜브 크기용 | |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
참고문헌
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Ibrahim, M. M.
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