파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

Summary

우리는 사육, 계란의 미세 주입 및 게놈 편집 후 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위해 파이어 브라트 Thermobia 국산의 효율적인 짝짓기를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

파이어 브라트 Thermobia 국내는 지구상에서 성공적인 진화 방사선을 주도 곤충의 발달 메커니즘을 연구에 적합한 병형, 날개없는 종입니다. 게놈 편집과 같은 유전 공구의 응용은 Evo-Devo 접근에 있는 진화적인 전환에 책임 있는 유전 변경을 이해하는 열쇠입니다. 이 문서에서는 T. 국산균의 돌연변이 균주를 생성하고 유지하기 위한 현재 프로토콜을 설명합니다. 우리는 우리가 주입된 태아에서 안정적으로 높은 생존율을 얻을 수 있도록 보고된 습식 주입 방법에 대한 대안으로, 건식 주입 방법을 보고합니다. 또한 성인을 짝짓기하고 고효율로 후속 세대를 얻기 위해 최적화된 환경 설정을 보고합니다. 우리의 방법은 비 전통적인 모형 유기체에 게놈 편집 방법의 성공적인 적용을 고려하여 각 종의 독특한 생물학을 취하는 의 중요성을 강조합니다. 우리는 이러한 게놈 편집 프로토콜이 실험실 모델로 T. 국내를 구현하고이 종에서 유용한 유전 도구의 개발 및 적용을 더욱 가속화하는 데 도움이 될 것으로 예측합니다.

Introduction

Thermobia 국내는 가장 기저 곤충 주문 중 하나에 속한다, Zygentoma, 이는 조상 과 날개없는 수명 주기를 유지. 이러한 기저 계통유전학적 위치와 조상특성은 이 종을 지구상의 곤충의 성공기막이되는 메커니즘을 연구하기 위한 매력적인 모델로 설정하여 기술된 동물종^1의70% 이상을 커버한다. T. 국내는 상대적으로 짧은 수명 주기 (태아에서 생식 성인에 2.5-3.0 개월)와 같은 실험실 모델로적합한 기능 때문에 곤충 생리학의 조상 특성을 연구하기 위해 주로 사용되어 왔습니다. 그림 1A) 그리고 쉽게 번식. 지난 3년 동안 신체 계획, 신경 분화 및 circadian 리듬^2,3,4와같은 다양한 특성의 조상 특성을 조사하기 위해 그 사용이 확장되었습니다.

T. 국내에서 고급 유전 도구의 응용 프로그램은 더 넓은 연구 분야에서 이러한 기여를 가속화 할 수 있습니다. 성공적인 RNA 간섭(RNAi)-매개 유전자 녹다운 배아, 님프, 및 성인은 T. 국도^4,5,6에서보고되었다. 전신 RNAi의 효율은 여전히 매우 종 의존성-예를 들어, 그것은 일반적으로 epidoptera 순서^7에서낮은 반면 콜옵테라에서 높다. T. 국내에서 RNAi 노크다운의 효율성과 기간은 아직 평가되지 않았습니다. RNAi 이외에, 우리는 이전에 T.^{국내8에서}성공적인 CRISPR / Cas9 중재 유전자 녹아웃을보고했다. CRISPR/Cas 시스템은 특히 표적 유전자 녹아웃을 위해 곤충의 게놈 편집을 위해 널리 적용되었습니다. 그 사용은 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 핵^9로전달하기 위한 프로토콜의 확립 후 외인성 구조를 노크함으로써 유전자 리포터 분석, 세포 계보 추적 및 전사 활동의 조작과 같은 다른 응용 분야에 대해 확장될 수 있다. 발표된 게놈^{어셈블리(10)와} 결합하여, T. 국내에서 CRISPR/Cas 기반 게놈 편집의 폭넓은 사용 및 추가 개발은 곤충의 뛰어난 적응적 성공 뒤에 있는 진화 메커니즘에 초점을 맞춘 연구를 용이하게 할 것이다. 여기서, 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 돌연변이 균주를 생성하기 위하여 배아 미세 주입및 짝짓기 성인 T. 국내를 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 이 새로운 방법을 고려하여, 우리는 이러한 기술의 성공적인 응용 프로그램에 대한 비 전통적인 모델 종의 독특한 생물학을 고려하는 중요성에 대해 논의.

Protocol

1. 실험실 식민지의 유지 보수

1. 야생형 및 돌연변이 집단의 유지를 위해 일반 인공 어류 식품이 있는 대형 플라스틱 용기(460mm x 360mm x 170mm)를 사용하고, 상단에 환기 구멍이 있는 플라스틱 컵의 물, 곤충을 숨기기 위한 접힌 종이, 계란을 낳을 수 있는 겹겹이 있는면(그림 2A)을사용한다. 모든 T. 국산 배양을 37°C 인큐베이터 내부에 보관하고 각 용기 내부에 상대 습도(RH)를 60%-80%로 설정합니다.
   참고: T. 국산은 ^{대기(11)로부터}수증기를 흡수하기 때문에 직접 수분 공급이 필요하지 않습니다. 적절한 RH는 상단에 환기 구멍을 포함하는 플라스틱 컵에서 수증기의 존재 또는 각 용기 내부의 뚜껑이없는 컵에서 유지된다. 문화가 포함된 전체 인큐베이터 내부에 가습기를 가습할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에 기재된 조건하에서 각 발달 단계의 대략적인 지속 시간은 도 1에도시된다. 개발 속도는 온도 및/또는 RH^12를변경하여 조정할 수 있습니다.
2. 주기적으로 음식을 추가합니다. 물이 마르기 전에 물을 넣습니다.
3. 성인이 더러운 환경 및 / 또는 조밀 한 인구에 계란을 누워 중지 주어진 적어도 3 개월마다 새로운 깨끗한 용기에 인구를 전송 (토론참조).

2. 계란 수집 및 미세 주입

1. 가이드 RNA(gRNA) 설계
   1. 각 요구 대상에 대한 gRNA 서열을 설계하고 가능한 오프 타겟 인식 부위를 확인하기 위해 게놈 어셈블리에 대한 gRNA 서열을 폭발한다.
   2. 제조업체의 지침^8에따라 gRNA를 합성하고 정화합니다.
      참고: 예를 들어, ATP 결합 카세트 수송기 백색 유전자를 표적으로 하는 경우, 20bp 표적 서열이 설계되었고 2개의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 5'-TAATACGACTCACTATAGTGTGTGTGTGTGTGGAC-3' 및 5'-TTCTAGCTCTAAAAAAAAAAAAACACACCCCCCCCCACAACAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAACACTAACAACACTAAACACTAACACTAAACACTAAACACTATAAACACTAAACACTAAACAACACTATAAACAACACTATAAACAACACTAAACAACACTAAACACTAAACACTAAACACTAAACACTAACACTAAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAAACACTAACACTATAAACACTAAACACTAACACTATAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTAACACTA DNA 템플릿은 PCR 증폭에 이어 이 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 제조되었으며 gRNA는 T7 RNA 폴리머라제로 템플릿으로부터 전사된 시험관내이다.
2. 계란 컬렉션 식민지 준비
   1. 약 20명의 남성과 20명의 여성 성인을 중간 크기의 용기(200mm x 150mm x 90mm)에 음식, 급수, 접힌 종이, 달걀 누워를 위한 작은 층면(그림2B)으로옮긴다.
   2. 게놈 편집에 사용되는 짧은 기간에 많은 수의 단계적 배아를 얻기 위해 여러 식민지를 설정합니다.
      참고: 약 20~40개의 알이 37°C에서 8시간 후에 식민지에서 수집될 것으로 예상됩니다. 그것은 일반적으로 새로운 환경에 적응 때문에, 알을 누워 시작하는 전송 성인에 대한 몇 일이 걸립니다.
3. 주입 당일, 용기 내부의 면화를 새로운 면으로 교체하십시오.
4. 일반 76mm x 26mm 유리 슬라이드에 76mm x 5mm 양면 테이프를 놓습니다.
5. 8시간 후, 집게를 사용하여 층을 분리하여 층면에서 계란을 수집합니다.
6. 젖은 페인트 브러시를 사용하여 양면 테이프에 계란을 정렬하고 계란 사이의 2mm 거리를 유지합니다. 모든 계란은 계란의 세로 축이 주사 측에 직면할 수 있도록 지향되어야 한다(그림 3A). 주사 중에 단단히 들고 페인트 브러시로 계란을 부드럽게 누릅니다.
   참고 : 이 프로토콜에서 곰팡이는 습하고 따뜻한 상태에서 손상된 주입 된 계란에서 빠르게 자랍니다. 교차 오염과 곰팡이의 확장을 방지하기 위해 계란 사이의 거리를 유지하는 것이 중요합니다.
7. gRNA와 Cas9 단백질을 각각 100 ng/μL 및 500 ng/μL의 최종 농도로 혼합합니다. 희석을 위해 증류수를 사용합니다. 리보뉴클레오단백질 복합체 형성을 촉진하고 얼음에 혼합을 유지하기 위해 실온에서 10 분 동안 믹스를 배양하십시오.
   참고: 1% 최종 농도에서 중성 적색을 주입된 양을 모니터링하기 위해 주입 용액에 첨가될 수 있다.
8. 마이크로 로더가 있는 유리 주입 모세관에 gRNA/Cas9 용액의 2 μL을 적재합니다. 주입 전에 용액에 기포가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 바늘을 눌러 거품을 제거합니다.
   참고:이 실험에서 기성바늘은 미세한 바늘 끝(도3B)을얻기 위해 사용된다. 비슷한 모양의 수제 바늘을 대신 사용할 수 있습니다.
9. 이전에 gRNA/Cas9 용액으로 로드된 유리 사출 모세관을 조작기가 장착된 홀더에 고정하고 홀더를 전자 마이크로인젝터에 연결합니다.
10. 일련의 주사(도 3C에적합한 바늘의 예)를 통해 막힘과 더 나은 내구성을 얻기 위해 집게로 약간 분해하여 바늘 팁의 모양을 최적화합니다.
    참고: 막힌 경우 바늘을 바꾸는 것이 좋습니다. 그것은 집게와 함께 다시 깨진 경우 동일한 바늘주입을 계속 할 수 있습니다., 하지만 넓은 팁 더 많은 계란 손상에 이르게 하 고 그들의 생존율을 낮춥니다. T. 국산 계란은 부드럽고 깨지기 쉬운, 미세 한 바늘 팁을 유지 하는 것은 주입 후 높은 생존율을 가지고 에 대 한 열쇠.
11. 계란의 세로 축의 중간점에 바늘을 삽입하고 약간의 양의 용액을 주입하십시오(주사량에 대한 참조를 위한 도 3D-H 참조). 바늘 끝의 모양에 따라 주입 중에 전자 마이크로 인젝터의 구성을 조정합니다.
    참고: 주입 하는 동안 일정한 압력을 적용 하는 것이 좋습니다., 그렇지 않으면 끈적 끈적한 계란 내용 물 유리 바늘에 쉽게 흐를 수 있습니다 그리고 그것을 막을 수 있습니다. 용액은 주입된 액체의 양에 따라 짧은 압력 펄스 또는 일정한 압력으로 주입할 수 있습니다. 바늘 팁이 넓은 개구부를 가지고 있을 때, 너무 많은 용액이 계란에 주입되어 치사(그림 3F-H)를유발합니다. 이 경우 일정한 압력으로 일정한 액체 흐름을 유지한 다음 바늘을 계란에 삽입하여 즉시 꺼냅니다. 너무 많은 오버플로우를 일으키거나 계란이 파열되면 바늘을 바꿉니다.
12. 주입된 계란의 수에 적합한 크기의 용기에 주입된 계란을 보관하십시오(&20 계란: 작은 접시; >20 계란: 중간 크기의 용기)와 60%-80% RH 및 37°C.

3화 짝짓기

1. 주입된 계란을 주기적으로 확인하고 곰팡이 성장을 피하기 위해 집게로 손상된 계란을 폐기하십시오(그림 3I, J). 계란에서 너무 많은 곰팡이가 자라면 계란 표면을 70 % EtOH로 청소하십시오.
2. 부화하기 전에 (계란 누워 후 37 °C에서 약 10 일), 양면 테이프의 표면을 코팅하는 활석 분말에 주입 된 계란과 유리 슬라이드를 찍어. 이것은 부화 된 님프의 스태킹을 피할 수 있습니다. 분말 코팅 유리 슬라이드를 음식, 물 및 접힌 종이가 있는 중간 크기의 용기로 옮겨 곤충을 숨기십시오.
3. 님프가 부화한 후 유리 슬라이드를 제거합니다. 성인이 될 때까지 주기적으로 식량을 공급합니다.
   참고: 개인이 부화 한 후 성인기에 도달하는 데 약 2.0-2.5 개월이 걸립니다(그림 1A). 성인 단계는 여성의 잘 발달 된 난란에 기초하여 판단된다(그림 1B).
4. 개인을 짝짓기 위해 실험실 식민지에서 중간 크기의 용기로 필요한 야생형 여성 성인을 옮기고 37°C에서 적어도 14일 동안 배양하여 처녀인지 확인합니다.
   참고 : 성인 T. 국내가 "생식 및 용해 주기"라고 불리는 몰링과 짝짓기의 반복 주기를 가지고 있기 때문에 실험실 식민지에서 처녀 여성을 수집 할 필요가 없습니다, 여성은 각 몰트와 정자를 버리고 다음 수정 주기^13에서다시 짝짓기.
5. 주입된 달걀과 야생형 성인에서 개발한 남성 또는 여성 G0 성인을 식품, 접힌 종이, 작은 면 조각으로 작은 플라스틱 접시(Ø 100mm x 40mm)로 옮기십시오(그림2C'및 짝짓기 접시). 짝짓기 접시를 60%-80% RH(그림2C)로더 큰 용기에 보관하십시오.
   참고: 여러 야생형 성인이 요리에 포함되어 성공적인 짝짓기의 기회를 높일 수 있지만 높은 성공률은 일대일 페어링으로 달성되었습니다.

4. 게노티핑

1. 각 gRNA에 대한 PCR 프라이머 쌍을 설계하여 gRNA를 대상으로 하는 사이트를 포함하는 100-200 bp 제품을 증폭시합니다. 각 프라이머 서열을 게놈 어셈블리에 대하여 폭발하여 그 특이성을 검사한다(도 4A에서 백색 유전자의 표적화를 위한 예가 도시됨).
2. G0 성인의 생식선 변형을 확인하십시오.
   1. 계란이 놓인 지 5일 후, 각 G0 성인 쌍에서 개별 G1 알을 0.2 mL 튜브(튜브 당 1개의 달걀; 장기 보관시 -20°C에서 수집한 샘플을 저장)로 수집합니다. 면층을 분리하여 계란을 수집합니다.
      참고: 각 짝짓기 쌍에서 최소 12G1 님프를 유전자형으로 사용하여 생식선 변속기의 성공을 평가하는 것이 좋습니다(대표 결과참조).
   2. 각 튜브에 0.25 mg/mL Proteinase K 용액(Tris-EDTA 버퍼에 용해)의 15μL을 추가하고, 이쑤시개로 시료를 잠시 균질화하고, 55°C에서 3~16h의 배양한다.
   3. 10 분 동안 95 °C에서 샘플을 배치하여 Proteinase K를 비활성화합니다.
   4. 각 튜브에 증류수 90μL을 넣고 잘 섞습니다. 4.1 단계에서 설계된 프라이머를 포함하는 10 μL PCR 반응 믹스에서 2 μL의 상체체를 사용하십시오.
      참고: 원유 템플릿에 최적화된 DNA 폴리머라제의 사용은 충분한 PCR 증폭에 도달하는 것이 좋습니다.
   5. PCR 제품을 분석하기 위해 마이크로칩 전기포고시스템(도3B;참조 Ohde et al., 2018)을 사용하여 이테로두플렉스이동성 분석(HMA)을 수행한다.
      참고: 돌연변이는 두 가지 대체 방법으로 평가될 수 있습니다: (1) 표준 젤 폴리머를 가진 HMA, 예8% 폴리아크릴라미드^14; (2) T7 엔도누리스를 함유한 PCR 제품의 소화, 아가로즈 젤^{전기포고증(15)이}뒤따랐다.
   6. G0 성인의 생식선에 돌연변이가 함유되어 있고 다른 것을 폐기하여 G1 님프만 보관하십시오.
3. G1 님프/어른의 개별 지피
   1. G1 님프를 흡구대 또는 페인트 브러시로 24웰 플레이트로 분리합니다. 상기와 같이 상급과 함께 24웰 플레이트를 더 큰 용기(예를 들어, 본 프로토콜에 사용되는 중형 컨테이너)에 놓아 RH를 60%-80%(도1D)를유지한다. 인공 일반 생선 식품의 공급을 유지(그림 1D').
      참고 : 이 단계는 님프칼과 성인 단계의 모든 지점에서 수행 할 수 있지만, 그것은 성인기에 도달 한 직후 페어링 하기 직전에 그것을 수행하는 것이 좋습니다 (>2.5 주사 후 개월; 그림 1B) 큰 용기에 불꽃을 유지하는 것이 더 쉽기 때문입니다. 개별 양육은 다음 단계에서 각 G1 님프의 유전자형을 추적하기 위해 필요합니다. 동일한 G0 성인의 G1 님프는 다른 돌연변이를 가질 수 있습니다.
   2. 집게를 사용하여 님프/성인으로부터 자궁과 소달 필라멘트를 꼬집고 당기고 50 μL EtOH가 들어있는 0.2 mL 튜브로 수집합니다(수집된 샘플을 장기 보관시 -20°C에 저장).
      참고: 정전기로 인해 이 작은 샘플의 손실을 방지하기 때문에 조직 샘플은 EtOH에서 수집됩니다. 곤충의 움직임을 중지해야하는 경우, 조직 샘플을 복용 할 때 얼음에 님프 / 성인을 마취. T. 국산은 얼음에 장기 냉각 후 살아남을 수 없기 때문에, 1 분 이상 마취하고 즉시 실온으로 다시 이동하지 마십시오. 자궁과 소달 필라멘트의 절제는 사망률의 증가를 유발하지 않습니다.
   3. EtOH를 증발시키기 위해 70°C에서 15분 동안 열 블록에 뚜껑이 열리는 샘플 튜브를 놓습니다.
   4. 지노티핑을 위해 4.2.2-4.2.5 단계를 반복합니다.
   5. 돌연변이 밴드 패턴이 표준 Sanger 시퀀싱 서비스에 관찰되는 PCR 제품을 제출합니다.
   6. 원하는 돌연변이를 가진 G1 님프/성인을 유지하고 다른 돌연변이를 폐기하십시오(대표 시퀀싱 결과에 대한 그림 4C 참조).
4. 짝짓기 접시에 원하는 돌연변이를 포함하는 성인을 교차하고 동형 가우성 돌연변이 균주를 확립하기 위해 다음 세대를 얻을.

Results

우리 손에는, 약 100개의 계란이 적당한 팁(도 3C)이있을 때 단 하나 주입 모세관으로 잘 주입될 수 있습니다. gRNA/Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체를 주사하여 계란 을 낳은 후 첫 8시간 내에 배아에 있는 gRNA 표적 부위에 인델이 생성된다. 이것은 주입된 생성 (G0)의 몇몇 세포에 있는 쌍경변 돌연변이를 일으키는 원인이 되고 이렇게 돌연변이 모자이크 표현형은 일반적으로 G0에서 수득됩니다. 예를 들어, 이 프로토콜이 백색 유전자를 표적으로 하도록 설계된 gRNA를 주입하는 데 사용되었을 때, G0 님프의 32.6%는 그들의 복합 눈과 등쪽 부위에서 색소침착의 부분적 손실을 나타낸다(그림5)^8.

현재 설명된 건식 주입 방법을 사용하여, 80-120개의 계란이 주입된 배아의 생존율이 40%-60%만큼 높...

Discussion

CRISPR/Cas9를 사용하여 원하는 T. 국산 돌연변이의 성공적인 생성을 위해, 주사를 위해 충분한 수의 단계적 배아를 수집하는 것이 우선이다. T. 국산 계란의 충분한 수의 일정한 컬렉션의 경우, 핵심은 모든 성인 몰트⁽¹³⁾후에 반복되는 일련의 복잡한 짝짓기 동작의 성공적인 완료에 도움이 될 것이기 때문에 낮은 인구 밀도를 가지도록 용기의 적절한 크기를 선택하는 것입니다. 남성 T. 국선 성인은 정자를 통해 여성에게 간접적으로 정자를 전달합니다. 스위트맨(1938)은 짝짓기 행동의 개시에서 20~35분 정도 걸리는 남성 성인이^{정자(12)의}배치에 걸린다고 보고했다. 다른 개인에 의해 짝짓기 쌍 사이의 상호 작용의 교란은 조밀 한 환경에서 더 자주 발생할 수있는 성공적인 수정을 방지 할 가능성이 높습니다.

계란은 우리의 프로토콜에 충분한 계란을...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24웰 플레이트	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µ g	Integrated DNA Technologies	1081060
정전기 방지 세정제	Hozan	Z-292	24웰 플레이트에서 정전기 제거용
배리어 박스 20.7L	AS ONE	4-5606-01	대형 용기
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	전자식 마이크로인젝터
Femtotip II, 주입 모세관	Eppendorf	5242957000	유리 주입 모세관
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	중형 용기
인큐베이터	Panasonic	MIR-554-PJ	for 37 ° C 배양. 인큐베이터 내부를 가습할 필요가 없습니다.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	PCR 효소. 조잡한 템플릿의 증폭에 최적화되었습니다.
마이크로 로더	에펜도르프	5242956003
마이크로 매니퓰레이터	Narishige	MM-3
			. 35X 이상의 배율은 마이크로 주입에 충분합니다.
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	마이크로칩 전기영동 시스템
NiceTac	Nichiban	NW-5	유리 슬라이드에 계란을 놓는 양면 테이프
페인트 브러시(말 털)	Pentel	ZBS1-0
식물 배양 접시	SPL Life Sciences	310100	대형 및 중형 용기에 대한 짝짓기 접시 및 물 공급
Proteinase K, 재조합, Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 현미경	림푸스	SZX 12	35X 이상의 배율은 미세 주입에 충분합니다
활석 가루	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold	Growth Spectrum Brands		인공 일반 생선 식품