여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
기존의 세포내 미세 전기 전극 기술은 심근세포 전기 생리학을 정량화하는 매우 복잡하고 노동 집약적이며 일반적으로 낮은 처리량에서 수행됩니다. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 신속하고 지속적인 확장은 심장 혈관 연구에서 새로운 표준을 제시하고 대체 방법은 이제 단일 세포 수준에서 전기 생리 학적 데이터의 처리량을 증가하는 데 필요한. VF2.1Cl은 최근 유래된 전압 민감 성 염료로, 멤브레인 전위변동에 대한 신속한 단일 채널, 높은 크기 응답을 제공한다. 다른 기존 전압 지표보다 우수한 운동학을 보유하고 있으며 기존의 미세 전극 기술과 동등한 기능성 데이터를 제공합니다. 여기서는 모듈식및 매우 저렴한 광합성 시스템을 사용하여 외부적으로 진행되는 인간 iPSC 파생 심근세포에서 단순화되고 비침습적인 작용 잠재적 특성화를 입증합니다.
서론
심근세포의 전기생리학적 모델링과 심장 약물 스크리닝을 위한 효율적인 플랫폼 구축은 다양한 부정맥 장애에 대한 치료 전략의 개발에 필수적이다. 유도 된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 기술의 급속한 확장은 고립 된 환자 파생 심근 세포 (iPSC-CM)를 사용하여 인간 질병 모델링 및 약리학적 조사에 유망한 진입을 일으켰습니다. 패치 클램프(current-clamp)를 통해 이들 세포의 전기생리학적 특성화를 위한 "골드 스탠다드" 기술은 작용 전위(AP) 형태및 지속시간을 정량화할 수 있지만, 이 방법은 매우 복잡하고 느리며 높은 처리량 데이터 수집1에적합하지 않다. iPSC-CM은 성인 토착 심근세포2에비해 확장막 전위 및 누출 전류가 증가하는 것으로 정기적으로 보고된다. iPSC-CM에서 관찰된 더 작은 세포 크기 및 감소된 막 정전용량이 현재 클램프 기술을 사용할 때 일부 체계적인 오류를 생성할 수 있으며, 아마도 이러한 편차를 설명할 수 있는 것으로나타났다3. iPSC-CM 플랫폼의 유용성을 극대화하기 위해 iPSC-CM의 단일 셀 수준에서 막 전압 변화를 특성화할 때 처리량을 늘리고 데이터 정확도를 보장하는 추가 방법이 중요합니다.
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프로토콜
1. 셀룰러 제제
참고: 본 프로토콜에 사용된 인간 iPSC는 건강한 기증자로부터 파생되고 이전에 설명된12,13,14와같이 WNT 시그널링 및 젖산 정제 기술의 완전히 정의된 소분자 변조를 사용하여 단층층에서 분화되었다. iPSC-CM은 아래설명된 문화 매체로 2-3일마다 유지되었습니다.
- 기저 배지(RPMI 1640) 및 2% 보충(B27)의 배양 배지를 준비한다. 4 °C에 보관하십시오. 실온(RT)에서 사용하십시오.
- 기초 매체(RPMI 1640), 2% 보충제(B27) 및 1:2000 ROCK 억제제의 도금 매체를 준비한다. 4 °C에 보관하십시오. RT에서 사용하십시오.
- 코팅 살균 10mm 원형 유리 #0 커버립 150 μL 1:60 인자 무료 지하 멤브레인 매트릭스와 4 h에 대 한 4°C에서 배양.
참고: 유출을 방지하기 위해 적절한 표면 장력을 유지하면서 유리 전체를 덮는 것을 보장하기 위해 커버슬립 볼륨의 최적화가 필요합니다. 10mm 둥근 커버립에 150 μL이 권장됩니다. 배치 크기, 커버 슬립 유....
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결과
도 3: 분리된 토착 심근세포 및 인간 유도만능 줄기세포의 광학 작용 전위(AP) 프로파일유래 심근세포(iPSC-CM). (A)APD 50 및 APD90(n= 7, 오른쪽)의 평균 ± SEM을 가진 단일 모린 심근세포(중앙)의 대표적인 광학 AP. (B)APD 50 및 APD90(n= 48, 오른쪽)의 평균 ± SEM을 가진 단일 인간 iPSC 유래 심근세포(중앙)의 대표적인 광학 AP. (C)iPSC-CM AP(중앙)의 약리학적 조작( 가운데) 1 μM 니페디핀. nifedipine 응용 프로그램 후 APD90
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토론
여기서 우리는 전기 생리학적 모델링 및 심장 약물 스크리닝에 적합한 격리된 iPSC-CM에서 상세한 AP 프로파일을 쉽게 획득하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 우리는 표시기 기능과 방법론 적 충실도를 모두 시사하는 희소하게 시드 된 iPSC-CM에서 정기적이고 견고한 AP를 감지합니다.
iPSC 재프로그래밍을 위한 광범위한 상용 방법론과 심장 분화 프로토콜에 대한 표준화 부족으로 인해 iPSC 기반 모델은 기능 및형태학(16)에서엄청난 가변성을 보여줄 수 있다. 이것은 또한 심장 독성 연구의 효과를 방해할 수 있습니다. 우리는 낮은 흥분 광 강도에 최소한의 지표 유도 세포 독성으로 확장 된 실험 조사에 일반적으로 강력한 반응을보고합니다. iPSC-CM 제제의 일관된 품질을 보장하기 위해서는 기본 해리 및 커버슬립 시드의 표준화가 중요합니다. 이미징 플랫폼 내부에 쉽게 삽입되고 교체할 수 있는 느슨한 커버립은 단일 심근세포의 신속한 .......
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공개 사항
케언 리서치(Cairn Research Ltd)는 비디오 파일의 제작 비용을 충당하여 이 출판물을 지원했습니다.
감사의 글
저자는 이 출판물의 생산 비용을 충당한 Cairn Research Ltd.의 친절한 재정적 기여에 대해 인정하고 싶습니다. 또한, 이네스 뮬러 씨와 스테파니 케스텔(Stefanie Kestel) 씨의 뛰어난 기술 지원에 감사드립니다.
저자의 연구는 심장 혈관 연구를위한 독일 센터에 의해 지원됩니다 (DZHK), 도이치 포르스충스게마인샤프트 (DFG, 독일 연구 재단, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 및 독일의 우수 전략 - EXC 2067/1- 390729940) 및 엘스 크뢰너-프레세니우스 스티프퉁(EKFS 2016_A20).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강력한>시약 | |||
| 0.25 트립신 EDTA | 기코 | ||
| B27 보충 | 기코 | ||
| CaCl2 | 칼 로스 | HN04.2 | |
| D(+)-무수 포도당 BioChemica | ITW 시약 | A1422 | |
| 태아 소 혈청 | 기코 | 10270-106 | |
| FluoVolt 막 전위 키트 | 인비트로젠 | F10488 | |
| HEPES | 칼 로스 | HN77.4 | |
| KCl | 시그마-알드리치 | 6781.1 | |
| 라마닌 | 시그마-알드리치 | 114956-81-9 | |
| 마트리겔 | BD | 354230 | |
| NaCl | 시그마-알드리치 | 9265.2 | |
| 니페디핀 | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 인비트로겐 | 15140 | |
| ROCK 억제제 Y27632 | 스테몰레큘 | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 중간 | 기코 | ||
| Versene EDTA | 기코 | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B 증폭기 | 분자 장치 | ||
| 원형 커버슬립, 두께 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | 분자 장치 | ||
| 이중 OptoLED 전원 공급 장치 | 케언 리서치 | ||
| ET470/40x 여기 필터 | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| 에칭 Neubauer 헤마사이토미터 | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | 케언 리서치 | ||
| IX73 도립 현미경 | 올림푸스 | ||
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| 멀티포트 어댑터 | 케언 리서치 | ||
| Myopacer 세포 자극기 | IonOptix | ||
| 옵토마스크 셔터 | 케언 리서치 | ||
| Optoscan 시스템 컨트롤러 | 케언 리서치 | ||
| PH-1 온도 제어 플랫폼 | 워너 인스트루먼트 | ||
| 광전자 증배관 검출기 | 케언 리서치 | ||
| PMT 증폭기 인서트 | 케언 연구 | ||
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| USB 3.0 컬러 카메라 | 이미징 소스 | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | 분자 장치 | ||
| IC 캡처 2.4 | 이미징 소스 | ||
| 프리즘 8 | 그래프패드 |
참고문헌
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
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