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방법 논문

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

2.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61897

⸱

2020년 11월 9일

 ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

이 논문에서

요약

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

초록

일반적으로 재배되는 일본 매실 품종은 원래 프룬누스 살리시나와 다른 프룬스 종 사이의 십자가에서 파생된 상호 특이적 하이브리드입니다. 대부분의 하이브리드는 여러 개의 알렐을 포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자체 비호환성을 나타낸다. 대부분의 재배 하이브리드는 자체 호환되지 않으며 꽃을 비옥하게하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다. 일본 매화의 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많기 때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자가(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 수작업 오염에 의해 결정되며, 그 다음으로 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 신장을 모니터링하고 현장에서 과일 성숙을 모니터링합니다. 수분화 품종의 선택은 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 현장에서의 개화 시간 모니터링을 결합하여 평가된다. 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종 의 선택이 가능하고 확립된 과수원의 수분 결핍과 관련된 생산성 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

서론

일본 매화(프룬스 살리시나 린들)는 중국1이원산지입니다. 19세기에 일본에서 미국으로 이 작물이 도입되어 다른 북미 디플로이드 자두2와교차했습니다. 20세기에, 이러한 하이브리드의 일부는 전 세계 온대 지역으로 확산되었다. 요즘에는 "일본 매실"이라는 용어는 원래 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 광범위한 상호 특이적 하이브리드를 말하며, 최대 15개의 다른 디플리드 Prunus spp.3,4,5.

일본 매화는 Rosaceae 가족의 다른 종과 마찬가지로 여러알렐을포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성(GSI)을 전시합니다. S-메뚜기는 피스틸로 발현된 리보누클레스(S-RNase)와 꽃가루 곡물7에서발현된 F박스 단백질(SFB)을 인코딩하는 두 개의 유전자를 함유하고 있다. 자가비호환성 반응에서, 꽃가루 곡물(haploid)으로 발현된 S-allele이 피슬틸(diploid)에 발현된 두 가지 중 하나와 동일할 때, 스타일 전반에 걸친 꽃가루 관RNA의 성장은 S-RNase8의작용에 의해 꽃가루 관 RNA의 저하로 인해 체포된다. 이 과정은 배란에서 여성 게임 토피의 수정을 방지하기 때문에, GSI는 품종 사이의 횡단을 촉진.

일부 일본 매실 품종은 자기 호환이지만, 현재 재배 된 대부분의 품종은 자기 호환되지 않으며, 자신의 꽃을 수정하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다3. 아몬드9,살구10,11,12 및 달콤한 체리13과같은 프루누스 속의 돌 과일 종에서는 품종의 수분 요구 사항을 다른 접근법에 의해 확립 할 수 있습니다. 자가(in)호환성은 현장에서 꽃의 자가 수분및 과일 세트의 후속 모니터링에 의해 결정될 수 있으며, 또는 실험실에서 제어된 조건에서 반 생체 자체 질립및 현미경14,15,16,17,18의 꽃가루 튜브 관찰에 의해 결정될 수있다. . 품종 간의 비호환성 관계는 잠재적 인 수분화 품종의 꽃가루를 사용하여 필드 또는 실험실에서 교차 오염에 의해 결정될 수 있으며, PCR 분석에 의해 각 품종의 S-alleles의 식별에 의해 결정될 수있다14,15,16,20,21,22 . 달콤한 체리 나 아몬드와 같은 종에서, 자체 (in)호환성은 또한 아몬드23에서달콤한 체리13 또는 Sf에서 S4'로 자기 호환성에 관련된 특정 S 알레일의 식별에 의해 평가 될 수있다.

주요 생산국의 여러 매실 사육 프로그램은 알 수없는 수분 요구 사항을 가진 새로운 품종2,14의숫자를 발표하고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자기(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 자체 오염에 의해 결정되며, 그 다음에형광 현미경 검사의 꽃가루 튜브를 관찰합니다. 수분화 품종의 선택은 현장에서 꽃 시간의 모니터링과 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별을 결합합니다.

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프로토콜

1. 현장에서 수분 수분

  1. 꽃가루 추출
    1. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 꽃가루를 얻으려면 스테이지 D24에서꽃봉오리를 수집하십시오.
      참고: 다른 가지각선 종보다 일본 매화에서는 꽃봉오리가 더 적게 생산되기 때문에 꽃봉오리가 더 많이 필요합니다.
    2. 플라스틱 메쉬(2mm x 2mm 모공 크기)를 사용하여 anther를 제거하고 실온에서 24시간 동안 종이에 놓아 주면 안소 침착이 가능합니다.
    3. 꽃가루 곡물을 미세 한 메쉬 (0.26 mm x 0.26 mm 모공 크기)를 체질하고 사용할 때까지 4 °C의 캡이있는 10 mL 유리 튜브에 보존하십시오.
  2. 꽃의 수분
    1. 꽃의 10%~20%가 열려 있을 때 여러 가지를 선택하고 레이블을 지정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면, 열린 꽃과 어린 싹을 제거하고 스테이지 D24에서꽃 봉오리만 남기고 있습니다.
    2. 손톱이나 핀셋으로 치료당 800~1,000개의 꽃봉오리꽃잎, 세팔, 창자들을 제거합니다.
    3. 손은 방출 후 24 h의 미세 한 페인트 브러시의 도움으로 피질을 수분합니다. 같은 품종의 꽃가루와 피슬의 절반을 포함하는 일부 가지, 대조군으로 다른 품종에서 호환 꽃가루와 다른 절반. 다른 품종의 꽃가루 곡물로 손가락 끝이나 페인트 브러시를 오염시키지 않도록주의하십시오.
    4. 꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 된 최종 과일을 정량화하기 위해 과일을 개발.
  3. 현장에서 의 추가 수분
    1. 첫 번째 꽃이 열리기 며칠 전에 0.8mm 메쉬 케이지에 선택된 나무를 둘러싸서 수분 곤충이 도착하는 것을 피하십시오.
    2. 10%-20%의 꽃이 열리면 수분 처리당 여러 가지를 선택하고 라벨을 부착하여 치료당 1,000-1,500개의 꽃을 남깁니다.
    3. 다음 날, 꽃이 열리면 해당 꽃가루 (자체 수분을위한 동일한 품종의 꽃가루및 교차 수분 제어와 같은 품종의 꽃가루)와 페인트 브러시의 도움으로 각 꽃을 수분하십시오.
    4. 모든 꽃이 열릴 때까지 격일로 수분공급합니다.
    5. 꽃의 주간 수를 기록하고 과일 드롭 패턴을 특성화하고 각 수분 처리에 설정 최종 과일을 정량화하기 위해 수확하기 위해 마취에서 과일을 개발.

2. 실험실에서 의 수중 오염

  1. BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 스테이지 D24에서50~100개의 꽃을 수집합니다.
  2. 실험실에서 치료 당 30 개의 꽃을 방출합니다 (자기 및 교차 수분).
    참고: 액슬에 손상을 방지하기 위해 신중하게 조광을 진행해야 합니다.
  3. 젖은 꽃집 거품 (각 수분 처리에 대한 거품의 한 조각)의 조각에 배치하기 전에 각 꽃 페디셀 수중의 바닥에 신선한 컷을 합니다.
  4. 손 은 이전에 수집 된 꽃가루와 미세 페인트 브러시를 사용하여 나중에 각 피스틸 24 시간 후 수분 (섹션 1.1 참조). 같은 품종의 꽃가루로 한 세트의 피스틸을 수분하고, 다른 세트는 호환되는 품종의 꽃가루를 대조합니다.
  5. 실온에서 수분 후 72h의 수분된 피스틸을 둡니다. 꽃 거품은 지속적으로 물로 젖어야합니다.
  6. 4°C에서 적어도 24시간 동안 에탄올/아세트산(3:1)의 고정 용액에서 피스틸을 수정합니다. 고정을 75%의 에탄올로 대체합니다. 샘플은27를사용할 때까지 4 °C에서이 용액에서 보존 될 수 있습니다.
    참고: 샘플이 솔루션에 완전히 잠겨 있는지 확인합니다.

3. 현미경 관찰

  1. 체외 꽃가루 발아의 평가
    1. 꽃가루 발아 매체를 정교하게 하려면 250mL의 증류수에 자당 25g을 녹인 다음 질산 칼슘 0.075 g [Ca(NO3)2]및 0.075 g의 붕산(H 3 BO3)을첨가하십시오.
    2. 용액에 2 g의 한고를 넣고 완전히 용해 될 때까지혼합하십시오 28.
    3. 매체를 살균하려면 120°C에서 20분 동안 자동 복제합니다. 매체를 냉각시키고 고화하기 전에 멸균 페트리 접시 당 3mL(55mm x 12mm)를 멸균 라미나르 플로우 후드에 분배합니다. 중간 정도의 고형화 후, 사용전까지 알루미늄 호일로 싸인 페트리 접시를 4°C로 보존하십시오.
    4. 이전에 두 페트리 접시에 제어 된 꽃가루 기증자로 사용 각 품종의 꽃가루를 확산하고 24 시간 동안 25 ° C에서 배양.
      참고: 접종된 배양 매체는 즉시 현미경 검사로 관찰하거나 사용전까지 -20°C에 저장될 수 있다. 이를 위해 페트리 요리는 현미경 관찰 전에 냉장고24h로 변경해야합니다.
    5. 꽃가루 곡물을 관찰하려면 칼로오스얼룩이 1 % (v /v) 애니라인 블루 용액을 준비하십시오. 먼저, 0.1N칼륨 인산염 삼각염(K3PO4)용액을 1,000mL에서K3PO4의 7.97g을 용해하여 준비한다. 1% (v/v) 애니라인 블루 용액을 정교하게 하기 위해 0.1 N K3PO4의100mL에서 애니라인 블루 1mL를 녹입니다.
    6. 각 페트리 접시에 2-3 방울의 애니라인 블루 용액을 추가하고 엑시터 필터 BP340-390 및 배리어 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스 현미경으로 5 분 후에 관찰하십시오. 플레이트 당 세 개의 필드에 실행 가능한 불가가 곡물을 계산, 각 필드는 포함 100-200 꽃가루 곡물, 각 품종에 대한 두 페트리 요리에.
  2. 꽃가루 튜브 성장
    1. 고정 된 피스틸을 증류수로 3 배 (각각 1 회, 총 3 시간)로 헹구고 24 시간 동안 4 ° C에서 5 % (w / v) 나트륨 황피염 (Na2SO3)으로이송합니다. 이 솔루션을 준비하려면 증류수 100mL에 설파이트 나트륨 5g을 녹입니다.
    2. 조직을 부드럽게 하기 위해 5%(w/v) 나트륨에서 8분 동안 120°C에서 피스트를 오토클랩합니다.
    3. 스쿼시 연화 된 피스틸은 1 % (v / v) 아일린 블루 용액을 슬라이드의 커버 유리 아래에 떨어뜨려 칼로스를 얼룩지게합니다.
    4. 엑시터 필터 BP340-390 및 장벽 필터 LP425를 사용하여 UV 에피플루오렌스와 현미경으로 스타일을 따라 꽃가루 튜브 성장을 관찰한다.

4. 비호환성 관계 결정

  1. 잎에서 DNA 추출
    1. DNA를 추출하려면, 필드에 있는 각 품종의 3-4 개의 젊은 잎을 수집, 바람직하게는 봄에.
      참고 : DNA는 성숙한 잎에서 추출 할 수 있지만 어린 잎의 DNA는 페놀 화합물이 적습니다.
    2. 상용 키트를 사용하여 DNA를 분리하고 제공된 프로토콜 키트를 따릅니다(재료 표참조).
    3. UV-Vis 미세볼륨 분광계에서 DNA 농도를 정량화하고 260 nm에서 각 샘플의 DNA 품질을 평가합니다. DNA 농도를 10 ng/μL로 조정합니다.
  2. 단편 증폭을 위한 PCR 조건
    1. 라벨 0.2 mL PCR 튜브 및 캡.
    2. 표 1에 따라 PCR 시약을 준비하고 얼음 위에 해동시키십시오.
    3. 반응당 16μL의 부피를 고려하여 반응 횟수와 초과 10%에 따라 각 프라이머 쌍의 마스터 믹스를 1.5mL 마이크로튜브에 설정합니다. 표 1에서 주문 후 시약을 추가하고 철저히 섞습니다.
    4. 각 0.2 mL PCR 튜브에 마스터 믹스의 Aliquot 16 μL은 DNA 템플릿4 μL 또는 멸균 증류수 4 μL을 음의 대조군(C-)으로 함유한다. 알려진 유전자형을 가진 품종의 DNA를 긍정적 인 대조군으로 사용하십시오. 부드럽게 섞고, 반응 튜브를 캡으로 닫고, 원심분리기를 30s에 2,000 x g로 닫고 반응 튜브의 하단에 있는 전체 부피를 수집합니다.
    5. 체온사이클러에 반응튜브를 배치하고 다음 온도 프로파일을 사용하여 PCR 프로그램을 설정: 94°C에서 3분, 94°C에서 1분의 35 사이클, 56°C에서 1분, 72°C에서 3분, 72°C에서 7분의 7분의 최종 단계를 설정한다.
  3. 단편 크기의 전기 전동 및 추정
    1. 1.7% (w/v) 아가로즈 미니 젤을 준비하려면 아가로즈 0.68 g와 1x TBE 버퍼 40mL을 100mL 에렌마이어 플라스크에 녹입니다. 끓는 것을 피하기 위해 전자레인지에서 600W 간격으로 가열하여 용액을 녹입니다.
    2. 용액이 벤치에 머무르면 식힌 다음 핵산 염색 용액의 3.5 μL을 추가하십시오.
    3. 젤 트레이를 주조 스탠드에 넣고 선택한 빗을 젤 몰드에 넣습니다. 각 PCR 제품 및 DNA 사다리에 대해 충분한 우물을 가져야 합니다.
    4. 아가로즈 용액을 젤 몰드에 붓고 중합될 때까지 식힙니다. 중합체 젤의 빗을 제거합니다. 젤의 표면을 덮을 수 있는 충분한 1x TBE 버퍼를 포함하는 수평 전기 전광 시스템에 젤을 놓습니다.
    5. DNA 분자량 사다리(1kb DNA 사다리)의 2μL로 첫 번째 및 마지막 우물을 적재합니다. 다른 우물에 PCR의 각 제품의 3 μL을 로드합니다. 챔버를 닫고 전원을 켜고 젤을 100 V에서 30 분 동안 실행합니다.
    6. 젤 문서화 시스템을 사용하여 UV 빛 아래에서 젤을 관찰하십시오. DNA 분자량 사다리를 사용하여 증폭된 단편의 크기를 결정하고 해당 알렐을 식별하기 위해 양성 대조군과 비교합니다.

5. 꽃 날짜 모니터링

  1. 서로 다른 년 동안 꽃에 각 품종의 다른 나무의 phenology를 모니터링할 수 있습니다. 꽃의 길이를 첫 번째 (약 5%)에서 마지막 열린 꽃 (약 95 %)까지 설정합니다. BBCH 스케일25,26의스테이지 65에 따르면 꽃의 50 % 이상이 F24단계에있을 때 만개한 것으로 간주됩니다.
  2. 호환 되는 품종의 꽃 날짜를 비교 하 고 매년 꽃 시간에 일치 하는 것을 결정 하려면, 몇 년에서 데이터와 꽃 시간의 달력을 정교 하 게.

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결과

일본의 매화 꽃봉오리에는 1~3개의 꽃이 들어있는 꽃이 들어 있습니다. 다른 돌 과일 종에서와 마찬가지로, 각 꽃은 네 개의 소용돌이로 구성되어 있습니다 : 카펠, stamens, 꽃잎, 그리고 꽃의 기지에서 컵을 형성하는 융합되는 세팔. 꽃 구조는 다른 돌 과일보다 작으며, 소량의 꽃가루 곡물을 포함하는 stamens로 둘러싸인 짧고 깨지기 쉬운 피질이 있습니다. 만개시, 각 꽃의 꽃은 짧은 줄기에 분리 된 것처럼 보이며, 무신 전 날에 녹색 세팔로 둘러싸인 풍선을 형성하는 흰색 꽃잎 (스테이지 D, 57 BBCH)(그림1A)을보여 주었습니다. 꽃은 마취에서 완전히 열리며, 마취제와 피스틸 (단계 F, 65 BBCH)(그림2A)을보여 주습니다. 다른 온화한 Prunus spp.처럼, 꽃 봉오리 먼저 열고, 잎 싹 은 며칠 후 새싹. 이렇게 하면 꽃이 피는 나무가 많은 꽃을 보여주는 장관을 이루지만 잎은 없...

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토론

본원에 설명된 방법론은 일본 매실 품종의 수분 요건을 위해 필드 또는 실험실에서 제어된 오염물질에 의한 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고, 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장의 후속 관찰을 요구한다. 비호환성 관계는 분자 지노티핑에 의한 S-alleles의 특성화에 의해 확립된다. 마지막으로, 수분 제의 선택은 매년 꽃에서 일치하는 그 품종을 검출하기 위해 모니터링 phenology에 의해 수행됩니다.

새로운 일본 매화형 품종에 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많고 그 대부분이 자체호환3이기때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 본 원에 기재된 접근법은, 페네로지모니터링, 통제된 오염, 형광 현미경 및 분자 지피핑을 결합하여,품종(14)의수분 요건을 결정하는 데 유용함을 입증했다.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00 및 RTA2017-00003-00);에 의해 투자되었습니다. 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12-17R), 그리고 준타 드 엑스트레마두라 —폰도 유럽오 데 데사롤로 지역 (FEDER), 계획 지역 드 Investigación (IB16181), 그루포 드 Investigación (AGA001, GR1819). B.I. 게레로는 멕시코의 콘세조 나시오날 드 시엔시아 이 Tecnología (CONACYT, 471839)의 펠로우십에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산 빙하Panreac131008.1611
한천iNtRON 생명 공학25999
아닐린 블루Difco8504-88
붕산 (H3BO4)Panreac131015.1210
질산칼슘 4-수화물(Ca(NO3)2 &미드닷; 4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
디지털 카메라이미징 개발 시스템UI-1490SE
디지털 카메라 소프트웨어 제품군이미징 개발 시스템4.93.0.
DNA 올리고ThermoFisher Scientific
dNTP 믹스, 각 10 mMThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA 중합효소ThermoFisher ScientificEP0713
에탄올 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA Ladder (미국 특허 번호 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016크기: 250µ g; Conc: 1.0 &마이크로; g/&마이크로; l
젤 문서화 시스템Bio-Rad1708195
핸드 카운터TamacoTM-4
이미지 랩 소프트웨어Bio-Rad이미지 분석 시스템 젤 문서화 시스템
MetaPhorAgarose Lonza50180
마이크로 원심분리기 5415 REppendorfZ605212
현미경 (UV 포함) epiflurescenceLeicaDM2500Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
MicroslidesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis SystemFisherbrand14955170
MinicentrifugeThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 분광광도계ThermoFisher ScientificND1000
페트리 디쉬Deltalab20020155 mm x 14 mm
인산 칼륨 Tribasic (K3PO4· 1.5H2O)Panreac141513
프라이머 포워드 'Pru C2'ThermoFisherScientific
프라이머 포워드 Pru T2'ThermoFisherScientific
프라이머 리버스 'PCER'ThermoFisherScientific
RedSafe 핵산 염색 솔루션iNtRON Biotechnology21141
SaccharosePanreac131621.1211
무수아황산나트륨(Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools 식물 DNA 추출 키트Biotools21272
TBE 버퍼(10X)PanreacA0972,5000PE
열 순환기 T100Bio-Rad
Thermomixer comfortEppendorfT1317
Vertical Autoclave Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
1861096

참고문헌

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