분변(마이크로) RNA 분리

세포외 RNA는 많은 생물학적 과정을 매개하는 중요한 요소로 인식되고 있습니다¹. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암과 활동성 궤양성 대장염의 표지자로 처음 보고되었으며², 최근에는 장 내강과 대변의 정상 구성 요소로 밝혀졌으며 숙주-미생물 통신을 매개합니다^3,4,5. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집한 배설물 샘플에서 고품질 세포외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 조정되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 염기서열분석, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기 위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA(microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변 내 미생물 RNA를 줄이고, 연구 조사의 변수를 제한하고, 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장내 RNA 구성을 분석하기 위함입니다. 주목할 점은 이 RNA 분리는 살아있는 세포와 살아있는 미생물(세포 RNA)에서 RNA의 방출을 최소화한다는 것입니다. 이 연구는 장 세포에서 방출되거나 음식 섭취를 통해 획득된 세포 외 RNA에 초점을 맞춥니다. 원칙적으로, 이 방법은 미생물 전사체를 조사하는 연구에는 적합하지 않습니다.

여기에 설명된 연구 동물과 관련된 모든 방법은 하버드 의과대학 브리검 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

여기에 설명된 인간 연구 대상과 관련된 모든 방법은 파트너 인간 연구 위원회가 정한 지침을 따릅니다.

1. 배설물 샘플 수집

1. 실험에서 각 동물 피험자에 대해 나사 캡이 있는 멸균 및 뉴클레아제가 없는 2mL 마이크로 원심분리기 튜브를 오토클레이브하거나 준비합니다.
   1. 인간 피험자의 경우, 각 피험자에게 적절하고 뉴클레아제가 없는 멸균 대변 표본 채취 장치를 제공합니다.
2. 멸균 환경에서 각 동물 피험자로부터 25-100mg(쥐 배설물 샘플의 경우 약 1-4개의 배설물 펠릿)의 배설물 샘플을 수집합니다.
   참고: 두 개 이상의 분변 펠릿(~50mg 이상)은 가장 높은 순도의 RNA를 얻기 위해 선호됩니다.
   1. 필요한 모든 개인 보호 장비(PPE) 및 재료(예: 실험실 장갑 한 켤레, 소독 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 사용하여 동물 연구 대상자가 있는 작업 영역을 살균하여 배설물 샘플 오염을 방지합니다.
      1. 인간 피험자의 경우, 각 연구 피험자/수집가에게 가능한 한 멸균된 환경에서 100-200mg의 대변 샘플을 수집하도록 지시합니다. 표준 멸균 작업을 사용하고 대변 표본 오염을 방지하십시오.
3. 오염을 방지하기 위해 다른 표면을 건드리지 않고 나사 캡이 있는 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 각 동물 피험자의 배설물 샘플을 직접 수집합니다.
   1. 인간 피험자의 경우, 오염을 피하기 위해 제공된 해당 채취 장치(예: 멸균 대변 표본 채취 키트)에 직접 배변하도록 지시합니다.
      알림: 피험자에게 변기 표면, 물, 소변 또는 기타 비멸균 표면/물체에 의한 오염을 피하도록 지시하십시오.
4. 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집된 대변 샘플을 -80°C에서 즉시 동결하거나 아래 단계에 설명된 대로 대변 재현탁 전에 RNA의 양과 품질을 개선하기 위해 드라이아이스 양동이에 넣습니다.
   1. 인간 대변 검체의 경우, 200mg의 각 신선한 검체를 나사 캡이 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취하고 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 -80°C에서 동결합니다.
      1. 나사 캡이 있는 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 있지 않은 대변 표본을 보관하려면 아래 설명된 대로 대변을 재현탁하기 전에 냉동 표본 각각을 100-200mg의 무게를 측정하여 나사 캡이 있는 별도의 2mL 미세 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
         참고: 인간 대변 검체의 경우 RNA 분리를 위해 200mg 이상의 대변 검체를 채취하면 다음 단계에서 어려움을 겪을 수 있으므로 피하십시오. 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 과부하된 시료를 사용하면 수성상, 유기상 및 계면이 명확하게 형성 및 분리되지 않을 수 있습니다. 여기에서 절차를 일시 중지할 수 있습니다.

2. 세척 용액의 준비

1. 병에 표시된 대로 미국화학회(ACS) 등급 100% 에탄올 21mL를 miRNA 분리 키트(재료 표 참조)에 제공된 세척 용액 1에 추가하여 최종 부피인 30mL에 도달합니다. 모든 것이 병에서 녹을 때까지 소용돌이.
2. 병에 표시된 대로 제공된 세척 용액 40/2에 ACS 등급 100% 에탄올 2/3을 추가하여 최종 부피 50mL에 도달합니다. 5초 동안 또는 최종 혼합물이 잘 혼합될 때까지 와류
를 사용합니다.

3. 장비 및 재료 준비

1. 작업 영역 및 장비(예: 실험실 벤치, 화학 흄 후드의 작업 영역 및 마이크로 원심분리기 튜브 랙)에 Ribonuclease(RNase) 오염 제거 용액(예: 상용 RNase 오염 제거 용액)을 스프레이합니다. 오염을 방지하려면 필요하다고 판단될 때마다 표면에 RNase 오염 제거 용액을 바르십시오.
2. 깨끗한 실험복을 입고, 안면 마스크를 착용하고, 적절한 실험용 장갑을 착용하여 인간 피부에 존재하는 뉴클레아제로부터 대변 샘플의 RNA를 보호합니다. 장갑에 RNase 오염 제거 용액을 뿌리고 장갑을 자주 교체하여 오염을 방지하십시오.
3. 대변 재현탁 전에 해동을 방지하기 위해 -80°C에 보관된 배설물 샘플에 대한 드라이아이스 양동이와 재료에 대한 얼음 양동이를 준비합니다(예: 산-페놀: 클로로포름, 유통 기한을 연장합니다.
   참고: 프로토콜에 사용된 배지를 포함한 물질이 뉴클레아제의 오염 없이 멸균되었는지 확인합니다.

4. 대변 재현탁

1. 25-100mg의 대변 샘플을 600μL의 멸균 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)에 재현탁합니다.
   주의: 대변 샘플은 샘플의 세포가 해동될 때 얼음 결정이 내부 및 외부 세포 구획을 모두 파열하므로 RNase 및 세포 RNA의 방출을 최소화하기 위해 부분적인 해동 없이 -80°C에서 해동할 때 즉시 처리해야 합니다.
   1. 실온(RT)에서 배설물 샘플이 들어 있는 나사 캡을 사용하여 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 600μL의 1x DPBS를 추가합니다.
   2. 600μL의 1x DPBS에 담근 대변 샘플 혼합물을 RT에서 30분 동안 캡을 씌운 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 배양합니다.
   3. 1mL 피펫 팁으로 으깨고 2mL 마이크로 원심분리 튜브를 캡으로 씌운 상태에서 와류를 잘 만들어 혼합물을 재현탁합니다. RNA의 양과 품질을 최적화하고 증가시키려면 S4000(또는 4000rpm) 및 45초에서 한 주기로 설정하여 혼합물을 균질기로 재현탁합니다.

5. 유기 추출

주의: 독성 및 인화성으로 인해 산-페놀: 클로로포름 및 ACS 등급 100% 에탄올을 사용하여 6단계까지 다음 단계에 대해 유해 화학 흄 후드를 사용하십시오. 필요에 따라 PPE를 변경하고 위험 물질을 다룰 때 적절한 표준 예방 조치를 따르십시오.

1. 600μL의 산-페놀: 클로로포름으로 RNA를 추출합니다(필요한 산-페놀: 클로로포름의 부피는 4.1단계에서 추가된 1x DPBS의 초기 부피와 동일).
   1. 600 μL의 산-페놀: 클로로포름을 단계 4.1.
      의 현탁액에 추가합니다. 참고: 산-페놀: 클로로포름을 병의 하부상에서 회수하여 상상이 수성 완충액과 혼합됩니다. 이 두 상 사이의 계면이 방해 받으면 계면이 오염을 피하기 위해 계면이 다시 자리 잡을 때만 기다렸다가 산-페놀 : 클로로포름을 회수하십시오.
2. 혼합물을 60초 동안 소용돌이쳐 완전히 섞입니다. 또는 수율에서 RNA의 양을 최적화하고 증가시키려면 S4000 및 45초에서 한 주기에 대한 설정과 함께 균질기를 사용하여 혼합합니다.
3. 실온에서 10,000 x g에서 15분 동안 원심분리기를 사용하여 마이크로 원심분리기로 수성 및 유기상을 분리합니다. 원심분리 후 계면은 조밀해야 합니다. 그렇지 않은 경우 centrifugation.
   를 반복합니다. 참고: 원심분리를 여러 번 반복한 후 첨가된 산-페놀: 클로로포름의 부피에 대한 초기 부피의 불균일한 비율로 인해 계면이 원하는 만큼 조밀할 수 없는 경우 오염을 방지하기 위해 더 세심한 주의를 기울여 수성상을 회수하십시오.
4. 수성상을 회수하고 힌지 캡이 있는 새로운 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다(miRNA 분리 키트에서 제공하지 않음).
   1. 하부상을 방해하지 않고 수성(또는 상위)을 조심스럽게 제거하고 힌지 캡이 있는 새로운 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 전송된 부피(예: ~500μL)를 확인합니다.
      참고: 계면이 조밀하고 상부상이 명확하게 분리되어 있을 때 수성상 상단에 몇 개의 작은 잔류 입자가 떠 있을 수 있습니다. 이러한 잔류물을 피하고 가시적이고 명확하게 분리된 수성상만 회수할 수 있도록 조심스럽게 피펫팅하여 소량의 수성상만 얻을 수 있는 경우에도 고품질 RNA 수율을 보장합니다.

6. 최종 RNA 분리

1. 2mL 마이크로 원심분리 튜브의 수용액에 1.25부피의 RT ACS 등급 100% 에탄올을 추가합니다(예: 5.4단계에서 500μL의 수성이 회수된 경우 625μL의 100% 에탄올 추가). 소용돌이 3 초.
2. miRNA isolation kit에 제공된 필터 카트리지를 통해 수성상/에탄올 혼합물을 로드합니다.
   1. 각 샘플에 대해 필터 카트리지를 키트에서 제공하는 수집 튜브 중 하나에 넣습니다.
      1. 피펫을 사용하여 600μL의 수성상/에탄올 혼합물을 필터 카트리지에 로드합니다.
         참고: 피펫팅하기 전에 혼합물을 잠시 와류로 만들어 에탄올과 수성상을 완전히 혼합합니다. 한 번에 700μL 이하의 수성상/에탄올 혼합물을 적재할 수 있습니다.
   2. 10,000 x g에서 90초 동안 원심분리기를 사용하여 혼합물을 여과합니다. 더 빠른 속도로 회전하면 필터가 손상될 수 있습니다.
   3. 여과액을 버리고 연속적인 적용에서 모든 혼합물이 동일한 필터 멤브레인을 통해 여과될 때까지 6.2.1-6.2.2단계를 반복합니다. 아래 세척 단계를 위해 동일한 수집 튜브를 보관하고 재사용하십시오.
   4. 700μL의 miRNA 세척 용액 1.
      로 필터를 세척합니다. 주의: miRNA 세척 용액 1에는 피부 자극과 심각한 눈 손상을 유발할 수 있는 구아니딘 티오시아네이트가 포함되어 있습니다. 예를 들어 장갑, 안면 보호대, 보호용 실험실 코트와 같은 필수 PPE를 착용하십시오. 필요에 따라 장갑을 자주 교체하십시오.
      1. ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 miRNA Wash Solution 1 700μL를 필터 카트리지에 도포합니다.
      2. 필터 카트리지를 통해 miRNA Wash Solution 1을 60초 동안 여과하기 위해 원심분리기.
      3. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
   5. 세척 용액 2/3로 필터를 700 μL, 500 μL 및 250 μL의 부피로 각각 한 번 연속으로 세척합니다.
      1. ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 700μL의 세척 용액 3을 필터 카트리지에 적용합니다.
         1. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기
         2. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
      2. 500μL의 세척 용액 2/3를 필터 카트리지에 도포합니다.
         1. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기
         2. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
      3. 250μL의 세척 용액 2/3를 필터 카트리지에 도포합니다.
         1. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기
         2. 수집 튜브에서 여과액을 폐기하십시오.
      4. 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮기고 어셈블리를 5분 동안 회전시켜 필터에 남아 있는 유체를 제거합니다.

7. 50μL 뉴클레아제가 없는 물로 RNA 용리

1. 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮깁니다. 뉴클레아제가 없는 물 50μL를 필터 중앙으로 피펫팅하고 수집 튜브를 닫습니다.
   1. 상온에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 8,000 x g에서 5분 동안 회전하여 RNA를 새 수집 튜브로 회수합니다.
   3. 형광측정기를 사용하여 회수된 대변 RNA의 농도와 순도를 측정합니다. 회수된 대변 RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

대표 RNA를 각각 50mg의 마우스 배설물 샘플(마우스 배설물 펠릿 2개) 및 100mg의 인간 대변 샘플에서 분리하고 50μL 뉴클레아제가 없는 물에 용출시켰습니다. 농도의 분광 광도계 분석은 총 49 μg 및 16 μg RNA가 각각 분리되었음을 시사합니다 (표 1). RNA 순도는 ~2.0의 A260/A280 비율과 ~1.8의 A260/A230 비율로 나타난 바와 같이 높았습니다(표 1). 보고된 바와 같이3, 대변에 있는 대부분의 RNA는 microRNA이며 이러한 microRNA는 엑소좀에 존재할 수 있습니다. 이와 일관되게 RNA의 칩 기반 전기영동 분석은 마우스 및 인간 배설물에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고 RNA 분리물의 크기가 작은 RNA 영역(그림 1A)에 속한다는 것을 시사합니다. 칩 기반 전기영동을 사용한 추가 소형 RNA 전기영동은 RNA의 상당 부분이 microRNA 크기임을 보여줍니다(그림 1B).이는 소형 RNA 바이오분석기를 사용하여 완료된 정량화가 이전 분석6으로 얻은 정량화와 유사하다는 관찰과 일치합니다.

표 1: 이 프로토콜로 분리된 RNA의 대표적인 나노드롭 분석. 대표적인 RNA는 50μL 뉴클레아제가 없는 물에 용출된 2개의 마우스 배설물 펠릿 또는 100mg의 인간 대변 표본에서 분리되었습니다. RNA 농도, A260/A280의 비율 및 A260/A230의 비율을 나노드롭으로 측정했습니다.

그림 1: 분변 RNA 분리물의 크기 분포에 대한 대표적인 칩 기반 전기영동 분석. (A) 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 2개의 마우스 배설물 펠릿(왼쪽 패널)과 100mg 인간 대변 시료(오른쪽 패널)에서 분리한 대표적인 RNA를 칩 기반 전기영동 분석을 사용하여 특성화했습니다. 이 분석법은 대부분의 RNA 분리물이 작은 RNA임을 시사합니다. (B) 그런 다음 분리물의 크기 분포를 분석하기 위해 칩 기반 전기 영동 시스템으로 작은 RNA 전기 영동을 실시했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이 프로토콜 논문에 설명된 연구 방법과 관련된 관련성 있거나 중요한 재정적 이익을 선언하지 않습니다.