방법 논문

분변(마이크로) RNA 분리

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DOI:

10.3791/61908

⸱

2020년 10월 28일

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리는 시퀀싱, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.

초록

RNA가 동물과 인간의 장 내강과 대변에 존재한다는 것이 분명해지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 microRNA를 포함한 전체 RNA를 분리합니다. 목표는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석을 위해 총 RNA를 고순도 및 양으로 분리하는 것입니다. miRNA 분리에서 이 최적화된 프로토콜의 장점은 설명된 추가 세척 단계를 통해 고도로 정제된 RNA 생성물을 분리하는 기능, 샘플 재현탁에서 개선된 방법으로 얻은 RNA의 양 증가, 중요한 오염 제거 팁입니다. 한 가지 한계는 이러한 샘플 크기가 간기의 명확한 형성에 어려움을 야기하기 때문에 200mg 이상의 더 큰 샘플을 처리하고 정제할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 큰 샘플 크기는 프로토콜에 설명된 대로 추출될 수성상을 최종적으로 분리된 RNA의 품질에 영향을 미치는 유기물로 오염시킬 수 있습니다. 그러나 최대 200mg의 샘플에서 분리 된 RNA는 대부분의 다운 스트림 분석에 충분합니다.

서론

세포외 RNA는 많은생물학적 과정을 매개하는 중요한 인자로 인식되고 있다1. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암 및 활동성 궤양성 대장염2의 마커로 처음 보고되었으며, 최근에는 장내강 및 대변의 정상 성분으로 밝혀졌으며 숙주-미생물 소통 3,4,5를 매개합니다. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집 한 분변 샘플에서 고품질 세포 외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 채택되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA (microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변의 미생물 RNA를 줄이고 연구 연구의 변수를 제한하며 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장의 RNA 구성을 분석하기 위해서입니다. 참고로, 이 RNA 분리는 살아있는 세포 및 살아있는 미생물(세포 RNA)에서 RNA의 방출을 최소화합니다. 장 세포에서 방출되거나 음식 섭취를 통해 획득 된 세포 외 RNA에 중점을 둡니다. 원칙적으로이 방법은 미생물 전사체를 조사하는 연구에는 적합하지 않습니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 연구 동물과 관련된 모든 방법은 하버드 의과 대학 브리검 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

여기에 설명 된 인간 연구 주제와 관련된 모든 방법은 파트너 인간 연구위원회가 정한 지침을 따릅니다.

1. 분변 샘플 수집

  1. 오토클레이브 또는 스크류 캡이 있는 멸균 및 뉴클레아제가 없는 2 mL 마이크로원심분리 튜브를 실험에서 각 동물 대상체에 대해 준비하였다.
    1. 인간 피험자의 경우, 각 피험자에 대해 적절하고 뉴클레아제가 없는 멸균 대변 표본 수집 장치를 제공합니다.
  2. 멸균 환경에서 각 동물 대상의 대변 샘플 25-100mg(마우스 분변 샘플의 경우 약 1-4개의 분변 펠릿)을 수집합니다.
    알림: 두 개 이상의 분변 펠릿(~50mg 이상)이 최고 순도의 RNA를 얻는 데 선호됩니다.
    1. 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
      1. 인간 피험자의 경우 각 연구 피험자 / 수집가에게 가능한 한 멸균 된 환경에서 100-200mg의 대변 샘플을 수집하도록 지시하십시오. 표준 멸균 작업을 사용하고 대변 표본 오염을 방지하십시오.
  3. 오염을 방지하기 위해 다른 표면을 건드리지 않고 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 각 동물 피험자의 분변 샘플을 직접 수집합니다.
    1. 인간 피험자의 경우, 오염을 피하기 위해 제공된 적용 가능한 수집 장치(예: 멸균 대변 표본 수집 키트)에 직접 배변하도록 각 피험자에게 지시합니다.
      알림: 변기 표면, 물, 소변 또는 기타 멸균되지 않은 표면/물체에 의한 오염을 피하도록 지시하십시오.
  4. 아래 단계에 설명된 대로 분변 재현탁 전에 RNA의 양과 품질을 높이기 위해 2mL 미세 원심분리 튜브에서 수집한 분변 샘플을 -80°C에서 즉시 동결하거나 드라이아이스 양동이에 넣습니다.
    1. 인간 대변 표본의 경우, 200mg의 각 신선한 검체를 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 분취하고 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 -80°C에서 동결합니다.
      1. 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 없는 대변 표본을 보관하려면 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 냉동 검체 100-200mg을 각각 칭량하고 스크류 캡이 있는 별도의 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
        알림: 인간 대변 표본의 경우 RNA 분리를 위해 200mg 이상의 대변 검체를 복용하면 다음 단계에서 어려움을 겪을 수 있으므로 피하십시오. 2mL 미세 원심분리 튜브에 과부하된 시료를 사용하면 수성상, 유기상 및 간상이 명확하게 형성되지 않고 분리되지 않을 수 있습니다. 여기서 절차를 일시 중지할 수 있습니다.

2. 세척액의 준비

  1. 21mL의 미국 화학 학회(ACS) 등급 100% 에탄올을 miRNA 분리 키트( 재료 표 참조)에 제공된 세척 용액 1에 추가하여 병에 표시된 대로 최종 부피 30mL에 도달합니다. 모든 것이 병에 녹을 때까지 소용돌이.
  2. 병에 표시된 대로 제공된 세척액 2/3에 ACS 등급 100% 에탄올 40mL를 추가하여 최종 부피 50mL에 도달합니다. 5초 동안 또는 최종 혼합물이 잘 혼합될 때까지 와동합니다.

3. 장비 및 재료의 준비

  1. 작업 영역 및 장비(예: 실험실 벤치, 화학 흄 후드의 작업 영역 및 마이크로 원심분리기 튜브 랙)에 리보뉴클레아제(RNase) 오염 제거 용액(예: 시판되는 RNase 오염 제거 용액)을 스프레이합니다. 오염을 방지하려면 RNase 오염 제거 용액과 함께 필요할 때마다 표면에 바르십시오.
  2. 깨끗한 실험실 코트를 입고 안면 마스크를 착용하고 적절한 실험실 장갑을 착용하여 대변 샘플의 RNA를 인간 피부에 존재하는 뉴클레아제로부터 보호하십시오. 장갑에 RNase 오염 제거 용액을 뿌리고 장갑을 자주 교체하여 오염을 방지하십시오.
  3. 대변 재현탁 전에 해동을 방지하기 위해 -80 ° C에서 보관 된 분변 샘플 용 드라이 아이스 양동이와 저장 수명을 연장하기 위해 산 페놀 : 클로로포름과 같은 재료 용 얼음 양동이를 준비하십시오.
    알림: 프로토콜에 사용된 배지를 포함한 물질이 뉴클레아제의 오염 없이 멸균되었는지 확인하십시오.

4. 대변 재현탁

  1. 25-100mg의 분변 샘플을 600μL의 멸균 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 재현탁합니다.
    주의 : 분변 샘플은 샘플의 세포가 해동 될 때 얼음 결정이 내부 및 외부 세포 구획을 파열하므로 RNase와 세포 RNA의 방출을 최소화하기 위해 부분 해동없이 -80 ° C에서 해동 될 때 즉시 처리되어야합니다.
    1. 실온(RT)에서 분변 샘플이 들어 있는 스크류 캡을 사용하여 2mL 미세 원심분리 튜브에 600μL의 1x DPBS를 추가합니다.
    2. 분변 샘플 600μL에 잠긴 1x DPBS의 혼합물을 RT에서 30분 동안 캡핑된 2mL 마이크로원심분리 튜브에 인큐베이션합니다.
    3. 1mL 피펫 팁으로 으깨고 뚜껑을 덮은 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 잘 와동하여 혼합물을 재현탁합니다. RNA의 양과 품질을 최적화하고 높이려면 S4000 (또는 4000rpm) 및 45 초에서 1 사이클 동안 설정된 균질 기가있는 혼합물을 재현탁하십시오.

5. 유기 추출

주의 : 독성 및 인화성으로 인해 산-페놀 : 클로로포름 및 ACS 등급 100 % 에탄올을 사용하여 6 단계까지 다음 단계에 유해 화학 흄 후드를 사용하십시오. 필요에 따라 PPE를 교체하고 위험 물질을 취급할 때 적절한 표준 예방 조치를 따르십시오.

  1. 600 μL의 산-페놀:클로로포름으로 RNA를 추출한다(필요한 산-페놀:클로로포름의 부피는 단계 4.1에서 첨가된 1x DPBS의 초기 부피와 동일함).
    1. 600 μL의 산-페놀:클로로포름을 단계 4.1의 현탁액에 첨가한다.
      참고: 산-페놀: 상부 상이 수성 완충액과 혼합됨에 따라 병의 하부 단계에서 클로로포름을 철회합니다. 이 두 단계 사이의 간기가 교란되면 오염을 피하기 위해 간기가 다시 확립 될 때만 산 - 페놀 : 클로로포름을 기다렸다가 철회하십시오.
  2. 혼합물을 60 초 동안 와동시켜 완전히 혼합하십시오. 대안적으로, 수율에서 RNA의 양을 최적화하고 증가시키기 위해, S4000 및 45 s에서 1 사이클 동안 설정된 균질기를 사용하여 혼합한다.
  3. RT에서 10,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 미세 원심분리기로 수성 및 유기상을 분리합니다. 원심 분리 후, 간상은 콤팩트해야한다. 그렇지 않은 경우 원심 분리를 반복하십시오.
    참고: 원심분리를 여러 번 반복한 후 첨가된 산-페놀:클로로포름의 부피에 대한 초기 부피의 비율이 고르지 않아 간기가 원하는 만큼 콤팩트할 수 없는 경우 오염을 피하기 위해 더 주의해서 성상을 회수하십시오.
  4. 수성 상을 회수하고 힌지 캡이 있는 새 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다(miRNA 분리 키트에서 제공하지 않음).
    1. 하부 상을 방해하지 않고 수성(또는 상부)상을 조심스럽게 제거하고 힌지 캡이 있는 새 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 전송된 부피(예: ~500μL)에 유의하십시오.
      참고 : 간기가 콤팩트하고 상부 상이 명확하게 분리되면 수성 상 상단에 몇 개의 작은 잔류 입자가있을 수 있습니다. 이러한 잔류물을 피하고 소량의 수성상만 얻을 수 있는 경우에도 고품질 RNA 수율을 보장하기 위해 가시적이고 명확하게 분리된 수성상만 회수하도록 조심스럽게 피펫팅하십시오.

6. 최종 RNA 분리

  1. 1.25 부피의 RT ACS 등급 100% 에탄올을 2 mL 미세원심분리 튜브 내의 수성상에 첨가한다(예를 들어, 단계 5.4로부터 500μL의 수성상을 회수하는 경우 625μL의 100% 에탄올을 추가한다). 소용돌이 3 초.
  2. miRNA 분리 키트에 제공된 필터 카트리지를 통해 수성상/에탄올 혼합물을 로드합니다.
    1. 각 샘플에 대해 필터 카트리지를 키트에서 제공하는 수집 튜브 중 하나에 넣습니다.
      1. 600μL의 수성상/에탄올 혼합물을 피펫팅하여 필터 카트리지에 넣습니다.
        참고: 피펫팅하기 전에 혼합물을 잠시 와동시켜 에탄올을 수용액과 완전히 혼합합니다. 한 번에 700μL 이하의 수성상/에탄올 혼합물을 로딩할 수 있습니다.
    2. 혼합물을 여과하기 위해 10,000 x g 에서 90초 동안 원심분리합니다. 더 빠른 속도로 회전하면 필터가 손상될 수 있습니다.
    3. 여과액을 버리고 모든 혼합물이 연속적인 적용에서 동일한 필터 멤브레인을 통해 여과될 때까지 6.2.1 내지 6.2.2단계를 반복한다. 아래 세척 단계에 동일한 수집 튜브를 보관하고 재사용하십시오.
    4. 700μL의 miRNA 세척 용액 1로 필터를 세척합니다.
      주의: miRNA 세척 용액 1에는 피부 자극과 심각한 눈 손상을 유발할 수 있는 구아니딘 티오시아네이트가 포함되어 있습니다. 필요한 PPE를 착용하십시오 (예 : 장갑, 안면 보호대, 보호용 실험실 코트). 필요에 따라 장갑을 자주 교체하십시오.
      1. ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 miRNA 세척 용액 1 700μL를 필터 카트리지에 적용합니다.
      2. 60초 동안 원심분리하여 필터 카트리지를 통해 miRNA 세척 용액 1을 여과합니다.
      3. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
    5. 세척액으로 필터를 2/3회 각각 700μL, 500μL 및 250μL의 부피로 연속적으로 세척합니다.
      1. ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 세척액 2/3 700μL를 필터 카트리지에 바릅니다.
        1. 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
        2. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
      2. 500μL의 세척액 2/3을 필터 카트리지에 바릅니다.
        1. 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
        2. 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
      3. 250μL의 세척액 2/3을 필터 카트리지에 바릅니다.
        1. 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
        2. 수집 튜브에서 여액을 폐기하십시오.
      4. 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮기고 어셈블리를 5분 동안 돌려 필터에서 잔류 유체를 제거합니다.

7. 50 μL 뉴클레아제가 없는 물로 RNA 용리

  1. 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮깁니다. 뉴클레아제가 없는 물 50μL를 필터 중앙에 피펫팅하고 수집 튜브를 캡핑합니다.
    1. RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
    2. RNA를 새 수집 튜브로 회수하기 위해 8,000 x g 에서 5분 동안 회전합니다.
    3. 형광계를 사용하여 회수된 분변 RNA의 농도와 순도를 결정합니다. 회수된 분변 RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

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결과

대표적인 RNA를 50mg 마우스 분변 샘플(2개의 마우스 분변 펠릿) 및 100mg 인간 대변 샘플에서 각각 분리하고 50μL 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시켰다. 농도의 분광 광도계 분석은 각각 49 μg 및 16 μg RNA의 총량이 분리되었음을 시사한다 (표 1). RNA 순도는 ~2.0의 A260/A280 비율 및 ~1.8의 A260/A230 비율로 표시된 바와 같이 높았다(표 1). 보고된바와 같이 3, 대변에 있는 대부분의 RNA는 마이크로RNA이며 이러한 마이크로RNA는 엑소좀에 존재할 수 있습니다. 이와 일치하게, RNA의 칩 기반 전기영동 분석은 마우스 및 인간 대변에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고, 분리된 RNA의 크기가 작은 RNA 영역에 속한다는 것을 시사합니다(그림 1A). 칩 기반 전기영동을 통한 더 ...

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토론

분리 7 동안 RNase 오염을 방지하기 위해 RNase가없는 기술을 사용하는 것이중요합니다. 원심분리 및 조밀한 간상의 형성 후, 성상을 회수할 때 간상, 하부상 및 수성상 상단에 떠 있는 입자 오염 물질을 피하는 것이 중요합니다. 또한 500μL 및 250μL 세척액 2/3을 사용한 두 가지 세척 단계가 추가되어 최적화된 품질을 위해 필터 멤브레인의 오염 물질을 제거합니다. 또한, 200mg 이상의 시작 샘플 물질은 간기의 명확한 형성에 어려움을 초래할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 유사하게, 25mg 미만의 샘플 물질은 다운스트림 분석을 위해 충분한 RNA 샘플을 추출하기에 충분하지 않을 수 있으므로 권장되지 않습니다.

마이크로바이옴 연구의 놀라운 성장은 미생물 종, 유전자의 측정을미생물 프로파일의 메타전사 연구로 이끌었습니다8. 대변의 MicroRNA는 질병 9,10,11

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공개 사항

저자는이 프로토콜 논문에 설명 된 연구 방법과 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 하버드 의과 대학의 바이오 폴리머 시설에서 바이오 분석기에 대한 기술 지원을 받았습니다. 이 연구는 국립 다발성 경화증 학회 연구 보조금 RG-1707-28516 (HLW 및 SL)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
산-페놀: 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Thermo Fischer Scientific14190-144
장갑
마이크로 원심분리기
mirVana miRNA 분리 키트Thermo Fischer ScientificAM1561
뉴클레아제가 없는 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL, 2 mL)
뉴클레아제가 없는 물(DEPC 처리되지 않음)Thermo Fischer ScientificAM9937
피펫터 및 뉴클레아제가 없는 피펫 팁(필터 포함)
PowerLyzer 24 HomogenizerQIAGEN13155
RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션Thermo Fischer ScientificAM9780
볼텍스 셰이커

참고문헌

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