Method Article

분변(마이크로) RNA 분리

DOI:

10.3791/61908

⸱

October 28th, 2020

 ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리는 시퀀싱, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.

Abstract

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RNA가 동물과 인간의 장 내강과 대변에 존재한다는 것이 분명해지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 microRNA를 포함한 전체 RNA를 분리합니다. 목표는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석을 위해 총 RNA를 고순도 및 양으로 분리하는 것입니다. miRNA 분리에서 이 최적화된 프로토콜의 장점은 설명된 추가 세척 단계를 통해 고도로 정제된 RNA 생성물을 분리하는 기능, 샘플 재현탁에서 개선된 방법으로 얻은 RNA의 양 증가, 중요한 오염 제거 팁입니다. 한 가지 한계는 이러한 샘플 크기가 간기의 명확한 형성에 어려움을 야기하기 때문에 200mg 이상의 더 큰 샘플을 처리하고 정제할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 큰 샘플 크기는 프로토콜에 설명된 대로 추출될 수성상을 최종적으로 분리된 RNA의 품질에 영향을 미치는 유기물로 오염시킬 수 있습니다. 그러나 최대 200mg의 샘플에서 분리 된 RNA는 대부분의 다운 스트림 분석에 충분합니다.

Introduction

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세포외 RNA는 많은생물학적 과정을 매개하는 중요한 인자로 인식되고 있다1. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암 및 활동성 궤양성 대장염2의 마커로 처음 보고되었으며, 최근에는 장내강 및 대변의 정상 성분으로 밝혀졌으며 숙주-미생물 소통 3,4,5를 매개합니다. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집 한 분변 샘플에서 고품질 세포 외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 채택되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA (microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변의 미생물 RNA를 줄이고 연구 연구의 변수를 제한하며 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장의 RNA 구성을 분석하기 위해서입니다. 참고로, 이 RNA 분리는 살아있는 세포 및....

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Protocol

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여기에 설명 된 연구 동물과 관련된 모든 방법은 하버드 의과 대학 브리검 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

여기에 설명 된 인간 연구 주제와 관련된 모든 방법은 파트너 인간 연구위원회가 정한 지침을 따릅니다.

1. 분변 샘플 수집

  1. 오토클레이브 또는 스크류 캡이 있는 멸균 및 뉴클레아제가 없는 2 mL 마이크로원심분리 튜브를 실험에서 각 동물 대상체에 대해 준비하였다.
    1. 인간 피험자의 경우, 각 피험자에 대해 적절하고 뉴클레아제가 없는 멸균 대변 표본 수집 장치를 제공합니다.
  2. 멸균 환경에서 각 동물 대상의 대변 샘플 25-100mg(마우스 분변 샘플의 경우 약 1-4개의 분변 펠릿)을 수집합니다.
    알림: 두 개 이상의 분변 펠릿(~50mg 이상)이 최고 순도의 RNA를 얻는 데 선호됩니다.
    1. 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
      1. 인간 피험자의 경우 각 연구 피험자 / 수집가에게 가능한 한 멸....

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Results

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대표적인 RNA를 50mg 마우스 분변 샘플(2개의 마우스 분변 펠릿) 및 100mg 인간 대변 샘플에서 각각 분리하고 50μL 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시켰다. 농도의 분광 광도계 분석은 각각 49 μg 및 16 μg RNA의 총량이 분리되었음을 시사한다 (표 1). RNA 순도는 ~2.0의 A260/A280 비율 및 ~1.8의 A260/A230 비율로 표시된 바와 같이 높았다(표 1). 보고된바와 같이 3, 대변에 있는 대부분의 RNA는 마이크로RNA이며 이러한 마이크로RNA는 엑소좀에 존재할 수 있습니다. 이와 일치하게, RNA의 칩 기반 전기영동 분석은 마우스 및 인간 대변에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고, 분리된 RNA의 크기가 작은 RNA 영역에 속한다는 것을 시사합니다(그림 1A). 칩 기반 전기영동을 통한 더 .......

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Discussion

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분리 7 동안 RNase 오염을 방지하기 위해 RNase가없는 기술을 사용하는 것이중요합니다. 원심분리 및 조밀한 간상의 형성 후, 성상을 회수할 때 간상, 하부상 및 수성상 상단에 떠 있는 입자 오염 물질을 피하는 것이 중요합니다. 또한 500μL 및 250μL 세척액 2/3을 사용한 두 가지 세척 단계가 추가되어 최적화된 품질을 위해 필터 멤브레인의 오염 물질을 제거합니다. 또한, 200mg 이상의 시작 샘플 물질은 간기의 명확한 형성에 어려움을 초래할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 유사하게, 25mg 미만의 샘플 물질은 다운스트림 분석을 위해 충분한 RNA 샘플을 추출하기에 충분하지 않을 수 있으므로 권장되지 않습니다.

마이크로바이옴 연구의 놀라운 성장은 미생물 종, 유전자의 측정을미생물 프로파일의 메타전사 연구로 이끌었습니다8. 대변의 MicroRNA는 질병 9,10,11

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Disclosures

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저자는이 프로토콜 논문에 설명 된 연구 방법과 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 하버드 의과 대학의 바이오 폴리머 시설에서 바이오 분석기에 대한 기술 지원을 받았습니다. 이 연구는 국립 다발성 경화증 학회 연구 보조금 RG-1707-28516 (HLW 및 SL)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
산-페놀: 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125:24:1)Thermo Fischer ScientificAM9720
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Thermo Fischer Scientific14190-144
장갑
마이크로 원심분리기
mirVana miRNA 분리 키트Thermo Fischer ScientificAM1561
뉴클레아제가 없는 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL, 2 mL)
뉴클레아제가 없는 물(DEPC 처리되지 않음)Thermo Fischer ScientificAM9937
피펫터 및 뉴클레아제가 없는 피펫 팁(필터 포함)
PowerLyzer 24 HomogenizerQIAGEN13155
RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션Thermo Fischer ScientificAM9780
볼텍스 셰이커

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al.

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Fecal RNA IsolationMicroRNA ExtractionAcid Phenol ChloroformRNA PurificationSample ResuspensionCentrifugation ProtocolFilter Cartridge WashNuclease Free WaterChip ElectrophoresisAbsorbance Ratio

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