이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리는 시퀀싱, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA가 동물과 인간의 장 내강과 대변에 존재한다는 것이 분명해지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 microRNA를 포함한 전체 RNA를 분리합니다. 목표는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석을 위해 총 RNA를 고순도 및 양으로 분리하는 것입니다. miRNA 분리에서 이 최적화된 프로토콜의 장점은 설명된 추가 세척 단계를 통해 고도로 정제된 RNA 생성물을 분리하는 기능, 샘플 재현탁에서 개선된 방법으로 얻은 RNA의 양 증가, 중요한 오염 제거 팁입니다. 한 가지 한계는 이러한 샘플 크기가 간기의 명확한 형성에 어려움을 야기하기 때문에 200mg 이상의 더 큰 샘플을 처리하고 정제할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 큰 샘플 크기는 프로토콜에 설명된 대로 추출될 수성상을 최종적으로 분리된 RNA의 품질에 영향을 미치는 유기물로 오염시킬 수 있습니다. 그러나 최대 200mg의 샘플에서 분리 된 RNA는 대부분의 다운 스트림 분석에 충분합니다.
서론
세포외 RNA는 많은생물학적 과정을 매개하는 중요한 인자로 인식되고 있다1. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암 및 활동성 궤양성 대장염2의 마커로 처음 보고되었으며, 최근에는 장내강 및 대변의 정상 성분으로 밝혀졌으며 숙주-미생물 소통 3,4,5를 매개합니다. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집 한 분변 샘플에서 고품질 세포 외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 채택되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA (microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변의 미생물 RNA를 줄이고 연구 연구의 변수를 제한하며 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장의 RNA 구성을 분석하기 위해서입니다. 참고로, 이 RNA 분리는 살아있는 세포 및....
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프로토콜
여기에 설명 된 연구 동물과 관련된 모든 방법은 하버드 의과 대학 브리검 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
여기에 설명 된 인간 연구 주제와 관련된 모든 방법은 파트너 인간 연구위원회가 정한 지침을 따릅니다.
1. 분변 샘플 수집
- 오토클레이브 또는 스크류 캡이 있는 멸균 및 뉴클레아제가 없는 2 mL 마이크로원심분리 튜브를 실험에서 각 동물 대상체에 대해 준비하였다.
- 인간 피험자의 경우, 각 피험자에 대해 적절하고 뉴클레아제가 없는 멸균 대변 표본 수집 장치를 제공합니다.
- 멸균 환경에서 각 동물 대상의 대변 샘플 25-100mg(마우스 분변 샘플의 경우 약 1-4개의 분변 펠릿)을 수집합니다.
알림: 두 개 이상의 분변 펠릿(~50mg 이상)이 최고 순도의 RNA를 얻는 데 선호됩니다.- 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
- 인간 피험자의 경우 각 연구 피험자 / 수집가에게 가능한 한 멸....
- 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
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결과
대표적인 RNA를 50mg 마우스 분변 샘플(2개의 마우스 분변 펠릿) 및 100mg 인간 대변 샘플에서 각각 분리하고 50μL 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시켰다. 농도의 분광 광도계 분석은 각각 49 μg 및 16 μg RNA의 총량이 분리되었음을 시사한다 (표 1). RNA 순도는 ~2.0의 A260/A280 비율 및 ~1.8의 A260/A230 비율로 표시된 바와 같이 높았다(표 1). 보고된바와 같이 3, 대변에 있는 대부분의 RNA는 마이크로RNA이며 이러한 마이크로RNA는 엑소좀에 존재할 수 있습니다. 이와 일치하게, RNA의 칩 기반 전기영동 분석은 마우스 및 인간 대변에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고, 분리된 RNA의 크기가 작은 RNA 영역에 속한다는 것을 시사합니다(그림 1A). 칩 기반 전기영동을 통한 더 .......
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토론
분리 7 동안 RNase 오염을 방지하기 위해 RNase가없는 기술을 사용하는 것이중요합니다. 원심분리 및 조밀한 간상의 형성 후, 성상을 회수할 때 간상, 하부상 및 수성상 상단에 떠 있는 입자 오염 물질을 피하는 것이 중요합니다. 또한 500μL 및 250μL 세척액 2/3을 사용한 두 가지 세척 단계가 추가되어 최적화된 품질을 위해 필터 멤브레인의 오염 물질을 제거합니다. 또한, 200mg 이상의 시작 샘플 물질은 간기의 명확한 형성에 어려움을 초래할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 유사하게, 25mg 미만의 샘플 물질은 다운스트림 분석을 위해 충분한 RNA 샘플을 추출하기에 충분하지 않을 수 있으므로 권장되지 않습니다.
마이크로바이옴 연구의 놀라운 성장은 미생물 종, 유전자의 측정을미생물 프로파일의 메타전사 연구로 이끌었습니다8. 대변의 MicroRNA는 질병 9,10,11
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공개 사항
저자는이 프로토콜 논문에 설명 된 연구 방법과 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 하버드 의과 대학의 바이오 폴리머 시설에서 바이오 분석기에 대한 기술 지원을 받았습니다. 이 연구는 국립 다발성 경화증 학회 연구 보조금 RG-1707-28516 (HLW 및 SL)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 산-페놀: 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| 장갑 | |||
| 마이크로 원심분리기 | |||
| mirVana miRNA 분리 키트 | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| 뉴클레아제가 없는 마이크로 원심분리기 튜브(1.5 mL, 2 mL) | |||
| 뉴클레아제가 없는 물(DEPC 처리되지 않음) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| 피펫터 및 뉴클레아제가 없는 피펫 팁(필터 포함) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션 | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| 볼텍스 셰이커 |
참고문헌
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al.
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재인쇄 및 허가
