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방법 논문

마우스에서 전신 지질 처리 용량 평가

4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61927

⸱

2020년 11월 24일

 ,  , 
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

이 논문은 마우스의 지질 대사를 평가하기 위한 3가지 쉽고 접근 가능한 에세이를 제공합니다.

초록

지질 대사를 평가하는 것은 신진 대사 기능을 평가하는 초석이며 생체 대사 연구에 필수적인 것으로 간주됩니다. 지질은 그들의 합성 및 신진 대사에 관련 된 많은 경로와 많은 다른 분자의 클래스. 영양 및 비만 연구를 위한 지질 hemostasis를 평가하기 위한 출발점이 필요합니다. 이 논문은 마스터하기 위하여 작은 전문 지식 또는 사례를 필요로 하는 3개의 쉽고 접근가능한 방법을 설명하고, 마우스에 있는 지질 대사 이상을 위해 검열하기 위하여 대부분의 실험실에 의해 적응될 수 있습니다. 이들 방법은 (1) 구강 내립내성 검사를 통해 식이 지질 처리 기능을 위한 상용 키트(2)를 이용한 여러 금식 혈청 지질 분자를 측정하고, (3) 약제화합물인 CL 316,243, 마우스에 대한 반응을 평가한다. 함께, 이러한 방법은 마우스에서 지질 처리 기능의 높은 수준의 개요를 제공 할 것입니다.

서론

탄수화물과 지질은 에너지 대사를 위한 두 가지 주요 기판입니다. 비정상적인 지질 대사는 타입 II 당뇨병, 심혈관 질환, 지방 간 질환 및 암을 포함한 많은 인간 질환을 초래합니다. 식이 지질, 주로 트리 글리세라이드, 림프계로 내장을 통해 흡수 하 고 심장 근처 chylomicrons에서 정맥 순환을 입력1. 지질은 혈류량의 지단백 입자에 의해 운반되며, 지방산 모이드는 근육 및 지방 조직2와같은 말초 기관에서 지단류 의 작용에 의해 해방된다. 나머지 콜레스테롤이 풍부한 잔재 입자는 간3에의해 지워집니다. 마우스는 지질 대사를 연구하기 위한 연구 모델로 실험실에서 널리 사용되어 왔습니다. 포괄적인 유전 도구 세트를 사용할 수 있고 상대적으로 짧은 번식 주기를 통해 지질이 어떻게 흡수되고 합성되고 대사되는지 연구할 수 있는 강력한 모델입니다.

지질 대사의 복잡성으로 인해, 정교한 지질학 연구 또는 동위원소 추적기 연구는 일반적으로 지질 종 또는 지질 관련 대사 플럭스와운명4,5의수집을 정량화하는 데 사용된다. 이것은 전문 장비 나 전문 지식이없는 연구자에게 엄청난 도전을 만듭니다. 이 논문에서는 기술적으로 도전적인 기술이 사용되기 전에 초기 테스트역할을 할 수 있는 세 가지 논문을 제시합니다. 그(것)들은 마우스를 위한 비 단말 절차이고, 따라서 지질 취급 용량에 있는 잠재적인 다름을 확인하고 영향을 받은 프로세스를 좁히는 데 아주 유용합니다.

첫째, 금식 혈청 지질 분자를 측정하는 것은 마우스의 전반적인 지질 프로파일을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스는 식사 후 많은 지질 종상승하기 때문에 금식해야하며, 증가 정도는 식단의 조성에 의해 강하게 영향을 받습니다. 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 비에스테르화 지방산(NEFA)을 포함한 많은 지질 분자는 흡광도를 읽을 수 있는 상용 키트 및 플레이트 판독기를 사용하여 측정할 수 있습니다.

둘째, 구강 내성 내성 검사는 흡수와 신진 대사의 순 효과로서 지질 처리 능력을 평가합니다. 구두로 투여된 내tralipid는 순환 트리글리세라이드 수준(1-2시간)에 스파이크를 일으키고, 그 후 혈청 트리글리세라이드 수준이 기저 수준(4-6시간)으로 돌아갑니다. 이 분석법은 마우스가 외인성 지질을 얼마나 잘 처리할 수 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 심장, 간 및 갈색 지방 조직은 트리글리세라이드의 활성 소비자이며, 흰색 지방 조직은 이를 에너지 매장량으로 저장합니다. 이러한 함수의 변경은 테스트 결과의 차이로 이어질 것입니다.

마지막으로, 저장된 지질을 동원하기 위해 lipolysis를 촉진하는 것은 체중 감량을위한 가능한 전략으로 간주됩니다. β3-adrenergic 수용체 신호 경로는 지방 조직에서 지방 조직에 있는 백혈구 lipolysis에 있는 중요한 역할을 하고, 인간 유전학은 비만과 상관되는 β3-adrenergic 수용체에 있는 기능다형성 Trp64Arg의 기능 상실을 확인했습니다6. CL 316,243, 특이적이고 강력한 β3-아드레너기능 수용체 작용제, 지방 조직 lipolysis 및 글리세롤의 방출을 자극한다. CL 316,243에 대한 마우스의 반응평가는 화합물의 효능의 개발, 개선 및 이해에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다.

전체적으로, 이 시험은 마우스의 지질 대사 상태에 있는 변경을 위한 초기 스크린으로 이용될 수 있습니다. 그들은 악기와 시약의 접근성을 위해 선택됩니다. 이 연구에서 파생 된 결과, 연구원은 그들의 동물의 신진 대사 적합성의 전반적인 그림을 형성 하 고 더 정교 하 고 대상된 접근 에 결정 할 수 있습니다.

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프로토콜

동물은 베일러 의과 대학 (BCM)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 동물 관리 및 실험 프로토콜에 따라 표준화 된 조건에 보관됩니다. 동물은 표준 또는 특별한 식단, 물 광고 리비툼을 공급하고 12 시간 주 /밤 주기로 유지됩니다.

1. 금식 세럼 지질 의 측정

  1. 마우스를 오후 5시 이후에 새로운 케이지로 옮기고 밤새 (실험 전에 약 16 시간의 금식)에 무료로 접근할 수 있습니다. 하룻밤 단식은 마우스의 위장관의 완전한 비우는 것을 보장합니다.
    참고 : 마우스는 금식 하는 동안 그들의 대변을 먹고, 그래서 음식 철수 적절 하 게 금식 보장 할 수 없습니다.
  2. 다음 아침, 꼬리에 마우스를 잡고 표면에 놓습니다. 마우스의 꼬리를 부드럽게 뒤로 당겨 마우스를 제지에 놓습니다. 마우스가 숨을 쉴 수 있도록 하면서 마우스의 움직임을 재교육하기 위해 코 구속을 놓습니다. 코 구속의 손잡이를 조입니다. 가슴 움직임을 모니터링하여 동물이 정상적으로 호흡하고 있는지 확인하고 마우스가 제지기에서 보내는 시간을 최소화합니다.
  3. 자유 이동 마우스의 꼬리 정맥에 피상적 절개 (닉)를 만들고, 마우스를 억제하지 않고 유리 모세관 (모세관의 약 1/3 채우기)에 절개에서 혈액의 25 μL을 그립니다. 신속하게 마이크로 원심 분리기 튜브에 혈액을 날려.
  4. 비타이스틱 파우더를 사용하여 출혈을 멈추고 케이지의 사료를 다시 채우고 쥐가 스트레스의 징후가 없는지 확인하십시오.
  5. 모든 마우스에 대한 혈액 철수를 완료합니다.
  6. 1 시간 동안 실온에서 방해받지 않고 방치하여 혈액이 응고되도록하십시오. 응고된 혈액 샘플을 4°C에서 4°C에서 10분간 냉장 벤치탑 미세원심분리기에서 10분간 회전시키고 분석을 위해 상류체(혈청)를 전달합니다.
    참고: 혈청은 분석전까지 몇 주 동안 -20°C에 보관할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 혈청을 -70°C로 유지하십시오.
  7. 제조업체의 제공된 프로토콜을 사용하여 각 지질 대사 산물을 분석합니다.

2. 구강 내측 내성 검사

  1. 오후 5시 이후에, 마우스의 무게를 측정하여 다음 날 그들에게 주어질 인트라피드 부피의 계산을 한다. 그런 다음 마우스를 새 케이지로 옮기고 하룻밤 사이에 빨리 (16 시간).
  2. 다음 날 아침, 한 케이지에 보관된 마우스의 꼬리를 표시하여 후속 출혈 단계에서 이를 식별할 수 있습니다.
  3. 꼬리 정맥에 닉을 만들고 유리 모세관 (모세관의 약 1/5을 채우기)에 절개에서 혈액의 15 μL을 그리고 신속하게 T = 0 혈청에 대한 미세 원심 분리 튜브로 혈액을 날려.
    참고: 쥐가 과도한 출혈을 보이지 않는 한 분석 중에 출혈을 멈출 필요가 없습니다.
  4. 가바게마우스는 18G 개비지 니를 사용하여 18G 개비지 니를 사용하여 체중 1그램당 15 μl의 비율로, 프리 금식 웨이트를 사용한다. 각 마우스를 1분씩 쌓아 두습니다.
    참고 : 동물의 무게를 측정하고 적절한 gavage 바늘 크기를 결정합니다. 일반적으로, 18 게이지 gavage 바늘은 마우스>25 g에 적합하며, 20-22 게이지 게이지 바늘은 더 작은 동물에게 더 적합할 것이다. 마우스를 으쓱하고, 어깨 위로 피부를 잡고 동물의 머리를 제자리에 고정시합니다. 입에 게가지 바늘을 놓고 식도에 도달할 때까지 위 쪽 입맛을 따라 부드럽게 전진합니다. 튜브는 저항없이 통과해야합니다. 적절한 깊이에 도달하면 인트라리피드를 천천히 관리할 수 있습니다. 인트라리피드를 관리한 후 바늘 삽입 시 동일한 각도로 바늘을 부드럽게 제거합니다. 동물을 케이지로 돌려보내 고된 호흡이나 다른 고통의 징후를 모니터링하십시오.
    참고: 구강 영역 이나 꼬리 출혈 기술에 경험이 없는 연구원은 2 분 이상 각 마우스를 스택수 있습니다.
  5. T = 1, 2, 3, 4, 5 및 6 시간에서 혈액을 그립니다 : 꼬리 출혈을 통해 마우스 당 혈액 15 μL (1/5 모세관)을 끌어 내고 혈액을 미세 센세리립후체 튜브로 빠르게 날려 넣습니다.
  6. 마이크로 센드심분리기에서 10분 동안 실온에서 2,000 x g의 혈액 샘플을 회전시합니다. 부동 지방 층을 포함한 상체를 PCR 튜브로 이송하여 보관합니다. 상체는 분석될 때까지 몇 주 동안 -20°C에 저장할 수 있습니다.
    참고: 상체는 플라즈마여야 합니다. 원심분리 시에 의해 이미 응고된 일부 샘플이 있는 경우 트리글리세라이드 측정에는 영향을 미치지 않습니다.
  7. 마지막 혈액 수집 후, 스티피스틱 분말을 사용하여 출혈을 중지, 케이지에서 사료를 다시 채우고, 쥐가 극단적 인 스트레스의 흔적을 표시하지 않도록.
  8. 트리글리세라이드 표준의 2 μL을 적재하고 수집된 초자연체를 96웰 플레이트에 넣습니다.
  9. 트리글리세라이드 시약 200μL를 추가하고 색상 개발을 위해 37°C에서 플레이트를 5분간 배양하게 하십시오.
  10. 실험실 플레이트 판독기에서 660nm의 기준 파장을 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하고 시료의 농도를 계산합니다.

3. β3 아드레너기식 수용체 아고니스트 CL 316,243 자극된 Lipolysis 분석

  1. CL 316,243을 멸균 식염수에 5 mg/mL(50x)의 스톡 솔루션으로 준비하고, 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
  2. 아침에, 실험에 필요한 희석 된 CL 316,243 용액의 양을 계산하기 위해 마우스를 무게. 마우스는 희석 된 CL 316,243의 체중 의 그램 당 10 μL을 받게됩니다, 1 mg / kg 체중의 최종 복용량.
  3. 생쥐를 물에 무료로 접근할 수 있는 새 케이지로 옮기고 4시간 동안 빠르게 처리합니다.
  4. 식염수를 사용하여 50배 재고로부터 충분히 1배 CL 316,243 솔루션을 만듭니다. 1x CL 316,243용액의 최종 농도는 0.1 mg/mL이다. 대조군 치료 그룹에 식염수 사용.
  5. 출혈 단계 동안 쉽게 식별할 수 있습니다.
  6. 꼬리 정맥에 닉을 만들고, 절개로부터 15 μL의 혈액을 유리 모세관 (모세관의 약 1/5 채우기)으로 끌어 내고 T = 0 샘플용 미세 원심 분리 튜브로 혈액을 신속하게 날려 넣습니다.
    참고: 쥐가 과도한 출혈을 보이지 않는 한 분석 중에 출혈을 멈출 필요가 없습니다.
  7. 희석 된 CL 316,243 용액 (또는 실험에 포함 되는 경우 제어) 10 μL/g 체급의 부피에 내회적으로 주입. 각 마우스를 1분씩 쌓아 두습니다. 각 60분 실험에 대해 최대 5마리의 마우스를 사용하거나 2인 팀에 10마리의 마우스를 사용하십시오.
  8. T = 5, 15, 30, 60 분에서 혈액을 그립니다 : 꼬리 출혈을 통해 마우스 당 혈액 (1/5 모세관)의 15 μL을 그립니다.
  9. 마지막 혈액 수집 후, 스티피스틱 분말을 사용하여 출혈을 중지, 케이지에서 사료를 다시 채우고, 쥐가 극단적 인 스트레스의 흔적을 표시하지 않도록.
  10. 냉장 된 미세 원심 분리기에서 5 분 동안 4 °C에서 2,000 x g에서 혈액 샘플을 회전시하십시오. 저장을 위해 상체를 PCR 튜브로 전송합니다. 상체는 분석될 때까지 몇 주 동안 –20°C에 저장할 수 있습니다.
  11. 2x 연속 희석 글리세롤 표준(0.156, 0.312, 0.625, 1.25 및 2.5 mg/ml 트리렐린-동등한 농도)의 1 μL을 적재하고, 96웰 플레이트에 수퍼나티를 수집하였다. 무료 글리세롤 시약 100μL을 추가하고, 색상이 발달할 수 있도록 플레이트가 37°C에서 5분간 배양하게 합니다.
  12. 실험실 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고 샘플의 농도를 계산합니다.

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결과

우리는 각 분석이 마우스의 지질 대사에 대한 귀중한 정보를 제공한다는 세 가지 발췌문으로 보여줍니다. C57BL/6J 남성 마우스의 경우 8주에서 8주간의 고지방 식단(HFD) 사료를 섭취하여 8주 동안 공급에 어려움을 겪고 있으며, 총 콜레스테롤 수치가 크게 상승했으며 혈청 트리글리세라이드와 NEFA는 그렇지 않았으며혈액내트리글리세라이드와 NEFA가 식이 지방 챌린지에 의해 주로 규제되지 않는다는 것을 시사합니다. 마우스의 두 번째 코호트에서, C57BL6 및 C57BL6/N 서브균소는 8주부터 시작하여 8주 동안 HFD를 공급하였다. 그들의 혈청 트리글리세라이드 수준은 구강 내 지질 도전 후에 비교되었습니다. 그 결과 6N과 6J 서브트레인 의 눈에 띄는 차이를 보였으며, 6J는 인트라피드 투여 후 혈청 트리글리세라이드 수준에서 현저히 높은 피크를 가지며, 흡수가 강화되었음을 나타내거나 훨씬 느린 트리글리세라이드 클리어런스(그림1)를나타냈다. 마지막으로, 일반 차우...

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토론

세 가지 애서에서는 몇 가지 중요한 고려 사항과 함께 실험실에서 기능을 강력하게 설명했습니다. 야간 금식은 금식 혈청 지질 수준 과 경구 내측 내성 시험을 결정하기 위해 필요합니다. 경구 내립 성 내성 검사의 경우, 특히 1 시간 및 2 시간 지점에서 지방 층의 형성을 최소화하기 위해 실온에서 혈액을 회전하는 것이 중요합니다. 형성하는 경우이 지방 층을 버리지 않는 것이 중요합니다. 상체를 지질 층으로 옮기고 부드럽게 파이펫을 섞어 트리글리세라이드 결단력을 확인하십시오.

금식 혈청 지질 수준의 해석
단식은마우스7에서총 콜레스테롤 수치를 낮추는 것으로 나타났으며, 만성적으로 고지방 함량을 섭취하면 총 콜레스테롤 수치가8을증가시킨다. 콜레스테롤의 두 가지 주요 유형이 있다: 고밀도 지단백-콜레스테롤 (HDL-C) 그리고 저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C). H...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 국립 보건원 (NIH), 보조금 R00-DK114498, 미국 농무부 (USDA), 보조금 CRIS에 의해 지원됩니다 : 3092-51000-062 Y. Z. Z.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20% IntralipidSigma AldrichI141
BD 슬립 팁 멸균 주사기 1mlShaotongB07F1KRMYN
CL 316,243 수화물Sigma-AldrichC5976
곡선 공급 바늘(18게이지)Kent ScientificFNC-18-2-2
유리 글리세롤 시약Sigma AldrichF6428
글리세롤 표준 용액시그마G7793
HR 시리즈 NEFA-HR(2)색상 시약 AFujifilm Wako 진단999-34691
HR 시리즈 NEFA-HR(2)색상 시약 BFujifilm Wako 진단991-34891
HR 시리즈 NEFA-HR(2)솔벤트 AFujifilm Wako 진단995-34791
HR 시리즈 NEFA-HR(2)솔벤트 BFujifilm Wako Diagnostics993-35191
Matrix Plus 화학 참조 키트Verichem9500
마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific14-222-168
미세혈구 모세관, 간화되지 않음Fisher Scientific22-362-574
NEFA STANDARD SOLUTIONFUJIFILM Wako Diagnostics276-76491
인산염 완충 식염수Boston BioproductsBM-220
Thermo Scientific 트리글리세리드 시약Fisher ScientificTR22421
총 콜레스테롤 시약Thermo ScientifiTR13421

참고문헌

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