Method Article

마우스 뇌를 기능적으로나 해부학적으로 다른 영역으로 미세 해부

DOI:

10.3791/61941

⸱

February 15th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Geneva Foundation, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 2Walter Reed Army Institute of Research, Medical Readiness Systems Biology, Center for Military Psychiatry and Neuroscience, 3ORISE Fellow, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 4Headquarter, Walter Reed Army Institute of Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌는 포유류 신경계의 지휘 센터이며 엄청난 구조적 복잡성을 가진 기관입니다. 두개골 내에서 보호되는 뇌는 대뇌 피질로 알려진 반구에 회색 물질의 외부 덮개로 구성됩니다. 이 층 아래에는 존재에 중요한 여러 현상에 필수적인 다른 많은 특수 구조가 있습니다. 특정 총 뇌 영역의 샘플을 획득하려면 빠르고 정확한 해부 단계가 필요합니다. 현미경 수준에서 많은 하위 영역이 존재하며이 해부의 목적을 위해 부과하는 임의의 지역 경계를 넘을 가능성이 있음을 이해합니다.

마우스 모델은 인간의 뇌 기능과 질병을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 유전자 발현 패턴의 변화는 병든 상태에 따라 특정 표현형을 표적화하는 특정 뇌 영역에 국한될 수 있다. 따라서, 잘 정의된 구조 조직과 관련하여 전사의 조절을 연구하는 것이 매우 중요하다. 뇌에 대한 완전한 이해는 뚜렷한 뇌 영역을 연구하고, 연결을 정의하며, 이러한 각 뇌 영역의 활동에서 주요 차이점을 식별해야합니다. 이러한 각각의 별개의 영역에 대한보다 포괄적 인 이해는 신경 과학 분야에서 새롭고 개선 된 치료를위한 길을 열어 줄 수 있습니다. 여기에서, 우리는 마우스 뇌를 열여섯 개의 별개의 영역으로 해부하기 위한 단계별 방법론에 대해 논의한다. 이 절차에서 우리는 수컷 마우스 C57Bl / 6J (6-8 주 된) 뇌 제거 및 신경 해부학 적 랜드 마크를 사용하여 여러 영역으로 해부하여 기능적으로 관련성이 높고 행동 관련 뇌 영역을 식별하고 샘플링하는 데 중점을 두었습니다. 이 연구는 신경 과학 분야에서 강력한 토대를 마련하여 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해에보다 집중적 인 접근 방식을 이끌어내는 데 도움이 될 것입니다.

Introduction

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뇌는 척수 및 망막과 함께 복잡한 행동을 실행하는 중추 신경계를 구성하며, 전신에 걸쳐 전문화되고 정확하게 위치하며 상호 작용하는 세포 유형에 의해 제어됩니다1. 뇌는 수십억 개의 상호 연결된 뉴런과 글리아교를 가진 복잡한 기관으로, 수많은 기능을 수행하는 정확한 회로를 갖추고 있습니다. 그것은 두 개의 뚜렷한 엽과 다양한 세포 구성 요소가있는 양측 구조입니다2. 척 수는 뇌를 외부 세계와 연결하고 뼈, 수막, 뇌척수액으로 보호되며 뇌2,3,4로 메시지를 주고받습니다. 뇌의 표면, 대뇌 피질은 고르지 않으며 자이리라고 불리는 뚜렷한 주름과 설치라고 불리는 홈을 가지고있어 뇌를 기능 센터로 분리합니다5. 피질은 작은 두뇌 6,7을 가진 포유류에서 매끄럽다. 다양한 뇌 영역과 관련된 장애와 기능 회로를 이해하기 위해 인간 뇌의 구조를 특성화하고 연구하는 것이 중요합니다. 최근 몇 년 동안 신경 과학....

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Protocol

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동물 취급 및 실험 절차는 동물 보호를위한 유럽, 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 현재 월터 리드 육군 연구소 (WRAIR)의 환경 건강 연구 센터 (WRAIR)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받은 시설에서 수행되었습니다.
참고: 절차는 자궁경부 탈구16에 의해 안락사된 C57BL/6j 균주의 6 내지 8주령 수컷 마우스에 대해 수행될 것이다. 우리 실험실에서는 관류가 수행되지 않지만이 프로토콜을 수정하여 혈관 구조에서 혈액을 맑게하기위한 관류를 수행 할 수 있습니다. 해부에 필요한 모든 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다. 해부는 뇌의 제거, 뇌하수체 제거 및 뇌 해부를 포함한 세 가지 구성 요소로 나뉩니다. 뇌 조직 수집의 목적은 RNA 추출 후 전사 분석을 위해 이들을 처리하는 것입니다. 뇌 영역이 해부되자마자, 우리는 즉시 각각의 뇌 영역을 이미 라벨이 붙은 냉동고 바이알로 옮긴 다음 바이알을 액체 질소 또는 -80°C에 보관한다.
참고 : 신경 해부학에 대한 철저한 지식은이 절차를 수행하는 데 필수적입니다. 수평 및 세로 섹션뿐만 아니라 일반적인 횡단 단면도 연구하고 배....

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Results

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복잡한 뇌 구조와 기능에 대한 우리의 이해는 빠르게 진화하고 개선되고 있습니다. 뇌는 여러 개의 별개의 영역을 포함하고 있으며 분자지도를 구축하면 뇌가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법 논문에서, 우리는 마우스 뇌를 여러 별개의 영역으로 해부하는 것에 대해 논의했다 (표 1). 이 프로토콜에서, 구조는 중요한 랜드 마크를 기반으로 확인되며 즉각적인 해부를 위해 견고성을 유지함으로써 조직을 식염수로 촉촉하게 유지함으로써 달성됩니다. 이 방법은 다른 보고서(21)보다 더 많은 영역을 다루며, 동결된 뇌(22,23)를 사용하는 해부 방법에 보완적이다. 이러한 해부 된 조직은 연구의 요구 사항에 따라 나중에 보존되고 처리 될 수 있습니다. 여기서 논의 된 방법은 두개골에서 뇌를 즉시 제거한 다음 마우스 뇌의 크기를 감안할 .......

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Discussion

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포유류의 뇌는 형태학적으로 뚜렷하고 기능적으로 독특한 세포들로 구성된 복잡한 기관으로, 다양한 분자 서명과 전문화되고 분리된 기능을 수행하는 여러 영역을 가지고 있다. 여기에 보고된 해부 절차는 실험실의 요구 사항에 따라 여러 목표를 가질 수 있습니다. 우리 실험실에서 우리는 스트레스16과 같은 PTSD에 노출 된 마우스에서 수집 된 여러 뇌 영역에서 전사를 평가했습니다. 우리는 균주 유전 배경24가 여러 뇌 영역의 발현 수준에 미치는 영향을 더 연구하고 싶습니다. 이 프로토콜에는 실험의 성공적인 재현성을 위해 고려해야 할 여러 중요한 단계가 있습니다. 뇌의 국소화된 영역들 각각은 신경병리학적 상태에서 뚜렷한 역할을 하며, 연구에 적합한 뇌 영역에 대한 상세한 지식이 부족하다. 따라서 뇌 영역과 관련된 데이터 세트를 생성하는 것이 중요합니다. 따라서, 데이터는 뇌 영역을 선택함으로써 질의될 뿐만 아니라 데이터 카테고리(예를 들어, 전사체, 단백.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험 지원을 해주신 Seshmalini Srinivasan, Stephen Butler 씨, Pamela Spellman 씨, 원고 편집을 해주신 Dana Youssef 여사에게 감사드립니다. USAMRDC의 자금 지원은 감사하게 인정됩니다. 제네바 재단은이 작업에 기여했으며 미 육군 연구 사무소를 통해 군사 및 운영 의학 연구 지역 국장 III의 기금으로 지원되었습니다.

면책 조항:

자료는 Walter Reed Army Institute of Research에서 검토했습니다. 그것의 프리젠 테이션 및 / 또는 출판에 대한 이의는 없습니다. 여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 사적인 견해이며 공식적이거나 육군부 또는 국방부의 진정한 견해를 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 연구는 동물 복지법 및 동물과 관련된 동물 및 실험과 관련된 기타 연방 법령 및 규정을 준수하여 AAALAC 공인 시설에서 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드, NRC 간행물, 2011 판에 명시된 원칙을 준수합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<강한>뇌제거
Deaver 가위Roboz Surgical StoreRS-67625.5" 스트레이트 샤프/샤프
Deaver 가위Roboz Surgical StoreRS-67635.5" 곡선 날카롭게/날카로운
섬세한 수술 가위Roboz Surgical StoreRS-67034.75" 곡선 샤프/샤프
섬세한 수술 가위Roboz Surgical StoreRS-67024.75" 직선 샤프/샤프
가벼운 수술 가위Roboz 수술 매장RS-67535" 곡선형 샤프/샤프
마이크로 주걱, 반경 및 테이퍼 플랫 엔드스테인레스 스틸 미러 마감
수술용 가위 6.5"Roboz 수술 매장RS-6846곡선형 샤프/샤프
조직 집게Roboz Surgical StoreRS-81604.5" 1X2 치아 2mm 팁 너비
Rongeur (선택 사항)Roboz Surgical StoreRS-8321 선택할 수 있는 다양한 스타일Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handleRoboz Surgical StoreRS-9843메스 핸들 #3 Solid 4"
및 블레이드Roboz Surgical StoreRS-9801-11멸균 메스 블레이드:#11 Box 100 40mm
초극세 집게 InoxRoboz Surgical StoreRS-4955팁 크기 0.025 X 0.005 mm
<강>뇌 박리
A 배율 바이저Penn Tool Col40-178-62.2x 외부 및 3.3x 내부 렌즈 배율, 직사각형 돋보기
해부 냉각판Cellpath.comJRI-0100-00A빙산 냉각판 및 베이스
Graefe 집게, 전체 곡선 매우 섬세한Roboz Surgical StoreRS-51380.5mm 팁 4" (10cm)
길이 가벼운 수술 가위Roboz Surgical StoreRS-67535" 곡선형 날카롭고 날카로운
메스 핸들Roboz Surgical StoreRS-9843 (위에서 반복)메스 핸들 #3 Solid 4"
및 블레이드(특히 #11)Roboz Surgical StoreRS-9801-11 (위에서 반복)멸균 메스 블레이드:#11 Box 100 40mm
주걱아마존MS-SQRD9-4더블 엔드 주걱 스퀘어 및 라운드 엔드
티슈 집게Roboz Surgical StoreRS-8160 (위에서 반복)4.5 "1X2 치아

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  2. Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
  3. P, T. L. S.

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Mouse Brain DissectionBrain Region IsolationNeuroanatomical LandmarksCerebral Cortex RemovalCerebellum DissectionHypothalamus SeparationThalamus IsolationAmygdala ExtractionHippocampus DissectionSeptal Nuclei Identification

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