코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

요약

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

초록

세포 재생 및 치료에 대한 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 효과를 연구하기 위해이 방법은 달팽이관 상피와 공동 배양 후 MSC 마이그레이션 및 형태 학적 변화를 추적합니다. 코르티의 장기는 해부 중에 생성된 Reissner 막의 일부를 눌러 플라스틱 커버슬립에 고정되었습니다. 실린더를 제거할 때 유리 실린더에 의해 수감된 MSC가 달팽이관 상피로 이동했습니다. 그들의 지배적인 국소화는 코르티의 기관의 modiolus에서 관찰되었다, 신경 섬유의 것과 유사한 방향으로 정렬. 그러나 일부 MsMC는 림푸스 지역에 국한되어 수평으로 길쭉한 모양을 보였습니다. 또한, 모발 세포 영역으로의 이동이 증가되었고, MSC의 형태는 가나마이신 치료 후 다양한 형태로 변경되었다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 달팽이관 상피와 MSC의 공존이 세포 이식을 통해 치료의 발달과 다양한 조건과 요인을 검사 할 수있는 세포 재생연구에 유용 할 것임을 나타냅니다.

서론

청력 손실은 선천적으로 발생할 수 있으며 노화, 약물 및 소음을 포함한 여러 가지 요인에 의해 점진적으로 발생할 수 있습니다. 청력을 담당하는 모발 세포가 손상되면 손상된 기능을 복원하기가 매우 어렵기 때문에 청력 손실은 종종 치료하기가^{어렵습니다.} 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계 4억 6,100만 명이 청력 손실을 입은 것으로 추정되며, 이는 전 세계 인구의 6.1%를 차지합니다. 청력 상실을 가진 사람들 중 93%는 성인이고 7%는 어린이입니다.

청력 손실을 치료하기 위해 여러 가지 접근 법이 시도되었습니다. 특히, MSC를 이용한 재생 접근법은 유망한 치료법으로 부상했습니다. 조직이 손상되면, MSC는 자연적으로 순환 계통으로 방출되고 다양한 분자를 분비하는 상해 부위로 이동하여 재생을 촉진하는 미세 환경을 형성한다^2. 따라서, 손상된 세포 기능3, 4, 5의 복원을 향상시키기 위해 강력한 면역 조절, 혈관신생 및 항 세포멸을 유발하는 분자의 장기 및 후속 분비를 표적으로 하는 외부 이식된 MSC의 이동을 통해 손상된 조직을 치료하는 방법을 개발하는 것이 중요하다^3,

프로토콜

ICR 마우스와 관련된 모든 연구 프로토콜은 원주의 의과대학의 연세대학교 기관동물관리및이용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었다. 이 프로토콜에서 임신 한 ICR 마우스는 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12/12 h 빛 / 어두운 주기에 보관되었습니다.

1. 달팽이관 해부

1. 30분 동안 자외선을 켜서 라미나르 유동 조직 배양 후드를 살균하고, 사용하기 전에 70% 에탄올로 모든 표면을 분무한다. 표면이 건조하도록 합니다.
2. 해부 악기를 70% 에탄올에 10분 동안 놓고 사용하기 전에 건조하십시오.
3. 수술 블레이드를 사용하여 산후 3-4 일 된 마우스(그림 2A)를참수하십시오.
4. 라미나르 플로우 후드의 스테레오현미경 아래에 두개골을 놓고 70% 에탄올에 티슈를 담그세요.
5. 조직을 빠르게 흡수하여 조직 해부 용액(1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액, 1mM HEPES)을 사용하여 에탄올을 제거합니다.
6. 수술 블레이드(그림 2B,C)로두개골의 중심선을 잘라.....

결과

3차원 모드에서 MSC의 체외 이동은 트랜스웰 시스템 또는 전통적인 상처 치유 방법에 의해 2차원(2D)^{모드(11)에서}마이그레이션을 관찰하도록 평가되었다. 코르티의 기관은 보처 세포, 클라우디우스 세포, 디터 세포, 기둥 세포, 헨센의 세포, 외부 헤어 셀, 내부 모발 세포, 신경 섬유, 바실라 막 및 망상 라미나^12와같은 다양한 세포로 구성된 복잡한 구조이다. 이러한 복잡한 세포로 구성된 조직으로 MSP를 이식할 때, 세포를 모집하고 안정화하는 위치를 확인하는 기술의 사용은 MSC를 사용하여 세포 치료 및 재생메커니즘을 이해하는 데 중추적인 역할을 한다. 또한, 손상의 유무에 따라 MSC가 국소화되는 방식을 결정하기 위해, 상처 치유 방법과 같은 2D 방법은 세포가 무작위로 한 방향으로 아래로 이동하는 트랜스웰 시스템보다 더 적합하다.

토론

손상된 세포의 재생을 촉진하기 위해 손상된 부위로 MSC를 이식하는 것은 광범위하게 연구되었으며 치료 효과가 분명합니다. MSC의 이식 및 후속 분화는 3-니트로프로피온산(13)에 의해 유도된난청을 가진 쥐의 청력을 회복하는 것으로 보고되었다. Lee et al.은 인간에게 MSC를 적용했지만,¹⁴번 청각에서 상당한 개선을 이루지 못했습니다. 최근까지, MSC 이식에 의한 설치류 모델에서 청력을 회복하기 위해 거의 12개의 실험이 수행되었다. 결과는 이질성 때문에 다소 불분명하지만, MSC가 청력을 촉진 할 수 있다는 몇 가지 징후가 있다.

화학요법과 관련된 다양한 성장인자 및 케모신은 이질성 또는 균질성에 관계없이 손상된 부위로 이식된 줄기세포의 이동에^{관여한다.} Chemokines는 조직 항상성, 면역 반응 및 상처 치유를 위한 세포 이동의 주요 조절.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10X PBS 완충액	GenDEPOT	P2100-104
4% 포르말린	T& I	BPP-9004
암피실린	시그마	A5354-10ml
BSA	시그마	A4503-100G
컨포칼 접시	SPL	200350
컨포칼 현미경	ZEISS	LSM800
커버슬립	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
소 태아 혈청	Thermo Fisher Scientific	16140071
가 있는 플루오쉴드		F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher 과학	14065056
HEPES	Thermo Fisher 과학	15630080
N2 보충제	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 시약	abcam	ab176759
스테이지 탑 인큐베이터	TOKAI HIT	WELSX
균주 C57BL/6 마우스 메시텐피 줄기세포와 GFP	시아겐	MUBMX-01101
Triton X-100	시그마	T8787

DAPI 시그마