Method Article

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

DOI:

10.3791/61949

⸱

November 7th, 2020

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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

In This Article

Summary

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PCD 진단을 위한 성공적이고 고품질의 섬모 기능 분석을 보장하려면 호흡기 상피 샘플링 및 처리를 위한 정확하고 신중한 방법이 필수적입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 PCD 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜이 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 업데이트되었습니다.

Abstract

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원발성 섬모 운동이상증(PCD)은 유전적 운동성 섬모병증으로 심각한 이인후성 질환을 유발합니다. PCD 진단은 다양한 진단 양식의 문제로 인해 종종 놓치거나 지연됩니다. PCD의 진단 도구 중 하나인 디지털 고속 비디오현미경(DHSV)을 사용하는 섬모 비디오현미경은 섬모 박동 주파수(CBF) 및 박동 패턴(CBP) 분석으로 구성된 섬모 기능 분석(CFA)을 수행하는 최적의 방법으로 간주됩니다. 그러나 DHSV에는 샘플 처리 및 분석을 위한 표준화되고 공개된 운영 절차가 없습니다. 또한 COVID-19 대유행 기간 동안 중요한 감염 통제 문제인 살아있는 호흡기 상피를 사용합니다. 이 건강 위기 동안 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜은 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 조정되었습니다.

여기에서는 섬모 호흡기 샘플의 샘플링 및 실험실 처리를 위한 수정된 프로토콜을 설명하고 COVID-19 감염 관리 조치를 준수하기 위한 조정을 강조합니다. 이 프로토콜에 따라 처리 및 분석된 16명의 건강한 피험자로부터 얻은 비강 칫솔질 샘플에서 CFA의 대표적인 결과가 설명됩니다. 또한 품질 선택 기준을 충족하지 않는 샘플이 이제 CFA를 허용하여 잠재적으로 이 기술의 진단 신뢰성과 효율성을 감소시키기 때문에 최적의 품질의 상피 섬모 스트립을 얻고 처리하는 것의 중요성을 설명합니다.

Introduction

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원발성 섬모 운동이상증(PCD)은 유전성 이질성 운동성 섬모병증으로, 호흡 섬모가 고정되어 있거나 느리거나 이상운동성이어서 점액섬모 청소율 장애 및 만성 이-중국-폐질환을 유발합니다 1,2,3,4. PCD의 임상 증상은 유아기 초기에 시작되는 만성 습기침 및 만성 코막힘, 기관지확장증을 유발하는 재발성 또는 만성 상기도 및 하부 호흡기 감염, 재발성 또는 만성 중이염 및 부비동염이다 5,6,7. PCD 환자의 약 절반이 좌측 또는 모호성 좌절과 같은 장기 편측성 결함을 나타냅니다. 일부 환자는 또한 남성의 고정성 정자와 여성의 나팔관의 고정성 섬모로 인한 불임 문제를 나타냅니다 1,2,8. PCD는 드물지만 유병률은 정의하기 어렵고 범....

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Protocol

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리에주 병원-교수 윤리 위원회와 직장 위생 및 건강 보호를 위한 대학 부서의 승인을 받았습니다.

1. 호흡기 섬모 상피 샘플링

  1. 샘플링 전에 피험자가 최소 4-6주 동안 감염되지 않았는지, 비강 및 흡입 약물이 없는지 확인하십시오.
  2. 보충된 M199 제제 준비: 항생제 용액(스트렙토마이신/페니실린 5mL(50μg/mL)) 및 항진균액(암포테리신 B 5mL(2.5μg/mL))으로 보충 세포 배양 배지 199(M199)(500mL)를 보충합니다.
  3. 뚜껑이 있는 15mL 원뿔형 튜브 2개(각 콧구멍에 하나씩)를 준비하고 각각에 보충된 M199 3mL를 채웁니다.
  4. 기관지 세포학 브러시 (두께 : 2mm 및 길이 : 11mm)를 준비하십시오. 브러시 길이가 약 15cm가 되도록 와이어 끝을 자릅니다(그림 1A,B). 비강 칫솔질을 할 때 칫솔을 잡으려면 Weil-Blakesley 비강 겸자를 사용하십시오(그림 1B).
  5. COVID-19 적응: COVID-19에 대해 알 수 없는 상태의 살아있는 비강 상피 ....

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Results

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이 기술의 효율성을 설명하기 위해 일련의 16명의 건강한 성인 지원자(남성 5명, 연령 범위 22-54세)에서 CFA의 결과를 제시합니다.

총 16명의 지원자 중 14명(남성 4명, 연령대 24-54세)의 비강 칫솔질 샘플은 CFA를 수행하는 데 필요한 선택 기준을 충족하는 적절한 상피 가장자리를 충분히 제공했습니다. 이 14개의 비강 칫솔질 샘플에서 총 242개의 섬모 가장자리가 기록되었고 212개의 가장자리가 정의된 포함 기준을 충족하고 분석되었습니다. 이들 모든 에지는 측면 프로파일에 기록되었다(관찰자 위로부터의 섬모 박동을 기록하고 분석하여 원형 CBP가 관찰되었는지 평가하기 위해 각 지원자에 대해13, 그러나 이러한 에지는 CFA에 포함되지 않았다). 총 807개의 CBF 측정 및 CBP 평가가 섬모 또는 분석된 섬모 그룹으로부터 얻어졌다(표 1). 각각의 건강한 대상체에 대한 CFA의 상세한 결과.......

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Discussion

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이 문서는 COVID-19 대유행 기간 동안 적절한 감염 관리 고려 사항을 조정하여 비강 칫솔질 샘플을 사용하는 CFA에 대한 표준 운영 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다. PCD 진단은 도전적이며 현재 비강 산화질소 측정, DHSV를 사용한 CFA, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 섬모 미세 구조 분석, 면역형광을 사용한 섬모 단백질 표지, PCD 유발 유전자에 대한 유전자 검사 등 국제 권고에 따라 다양한 진단 테스트 패널이 필요합니다 4,37. 현재 PCD 4,37을 가진 모든 환자를 진단할 수 있는 단일 검사는 없습니다. 유럽 호흡기 학회 가이드라인에 따르면, TEM에 의한 특징적인 미세구조적 결함 및 PCD 유발 유전자의 이중 대립유전자 돌연변이만이 PCD 진단을 확인할 수 있습니다. 불행하게도, 이 검사는.......

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Disclosures

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이 저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier 및 Paris-Est PCD 진단 센터의 모든 팀원들이 PCD 진단 센터를 방문하는 동안 가용성과 진심 어린 환영을 받고 수많은 교류에 감사드립니다. 또한 로버트 허스트 (Robert Hirst)와 레스터 PCD 센터의 모든 팀원들의 환영과 시간, 조언 및 전문 지식에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 원뿔형 튜브FisherScientific35209615 ml 고선명도 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 뚜껑
포함 Amphotericin BLONZA17-836E항진균 용액
Blakesley-weil 비강 겸NOVO SURGICALE7739-12비강 칫솔질을 수행하기 위해 브러시를 잡는 데 사용됩니다
기관지 세포학 브러시CONMED129비강에 사용됩니다. 칫솔질
봉NUOVA APTACA2150/SGCOVID-19 테스트에 사용
디지털 고속 비디오 현미경 카메라IDTeu 모션 혁신CrashCam Mini 1510
유리 슬라이드ThermoScientific12372098시각화 챔버를 만드는 데 사용되는 현미경 슬라이드
가열 상자초점의 IBIDI 세포10918가열에 사용
샘플 반전 광 현미경ZeissAXIO Vert.A1
렌즈 히터TOKAI HITTPiE-LH오일 이멀젼 렌즈
Medium 199 (M199), HEPESTermoFisher Scientific12340030세포 배양 Medium
Motion Studio X64IDT Motionversion 2.14.01Software
OilFischerScientific, Carl Zeiss
직사각형 커버 슬립VWR631-0145시각화 챔버를 덮는 데 사용
스페이서 (Ispacer) 0.25 mmSunjinlabIS203밀폐 된 시각화 챔버 생성에 사용
스퀘어 커버 슬립VWR631-0122
을 만드는 데 사용됩니다.FisherScientific, Gibco11548876항생제류 솔루션
자 면11825153 실험실에서 제작 한 개방형 시각화 챔버 Streptomycin / Penicillin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H.

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