HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

요약

식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.

초록

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

서론

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제^1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드^3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다^4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.

뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시....

프로토콜

1 식물 성장 및 재료 수집

1. 아라비도시스 씨앗을 70% 에탄올로 살균하고 1반강도 무라시게와 스쿠그 영양소로 제조된 한천 접시에 뿌려야 합니다.
2. 48h에 대해 4°C에서 어둡게 아라비도시스 씨앗을 함유한 플레이트를 배양한 다음, 22°C에서 55 μmol^{m-2 s-1의} 16h 빛 아래 제어된 성장 챔버로 옮기고 20°C에서 8시간 어둡게 옮깁니다.
3. 2주 묘목 100mg(신선한 체중)을 수확하고 대사 산물 추출을 위해 액체 질소를 동결하십시오.
   주의: 연구원은 재료 수집 중에 인간 조직 오염을 피하기 위해 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트를 적절하게 착용해야합니다.

2 뉴클레오시드/뉴클레오티드 추출

1. 60Hz 의 주파수에서 5 분 동안 사전 차가운 믹서 밀에 7-8 강철 구슬이있는 냉동 식물 조직 100 mg을 접지하십시오.
2. 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 포함하는 추출 용액을 2:2:1의 비율로 준비한다.
3. 1mL의 추출 용액으로 균질화된 물질(대부분의 대사산물포함하지만 단백질은 포함되지 않음)을 다시 중단합니다.
4. 4°C에서 15분 동안 1....

결과

여기서, 우리는 2주 된 아라비도시스 야생 형 (Col-0) 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N¹-메틸라데로신의 식별 및 정량화를 예로 들 수 있습니다. 질량 분석 프로파일은 N 1-메틸라데로신 표준으로부터 생성된 제품 이온이 150m/z 및 133m/z(도2A)이며동일한 프로파일도 Col-0 추출(도2B)에서관찰된다는 것을 나타낸다. 150m/z의 높은 제품 이온으로 인해 282.1에서 150(m/z)의 질량 전환이N 1-메틸라데노신 정량화에 선택됩니다. 또한, 목표피크(도 3B)의보유 시간(RT)은 7.05분이며, 이는 N 1-메틸라데로신 표준(도3A)의RT와 동일하다.

토론

유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법을 채택해야 합니다. 여기서, 우리는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 검출을 위한 질량 스펙트럼을 이용한 프로토콜을 기술했다. 예를 들어 N 1-메틸라데노신을 예로 들면, 이 방법은 0.02 ng 표준으로 낮은 것을 검출할 수 있고 교정 곡선의 정확도는 매우 높다(R² = 0.999; 그림 4B). HPLC 방법과 비교하여 MS 기반 프로토콜은 훨씬 더 나은 검출 제한과 정확도를 제공합니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 LC-MS/MS가 있는 생물학 실험실에 있는 연구원에 의.......

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴	Sigma-Aldrich	1000291000
아데노신	Sigma-Aldrich	A9251-1G
암모늄 아세테이트	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
시티딘	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
구아노신	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb 컬럼	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
이노신	Sigma-Aldrich	I4125-1G
메탄올	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-메틸아데노신	Carbosynth	NM03697
O6-메틸구아노신	Carbosynth	NM02922
무라시게와 스코그 배지	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A 컬럼	Agilent Technologies	A2000050X046
유사유리딘	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
유리딘	Sigma-Aldrich	U3750-1G

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