방법 논문

골수 유래 대식세포의 분리, 배양, 분극 및 해당작용 특성화를 위한 포괄적인 고효율 프로토콜

DOI:

10.3791/61959

⸱

2021년 2월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 3Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 살아있는 골수 유래 대식세포(BMDM)의 해당작용 대사 상태의 분리, 배양, 분극 및 측정을 위한 상세하고 포괄적인 방법을 제공합니다. 이 백서는 실시간으로 BMDM의 워크플로우 및 해당작용 평가를 위한 사실적인 시각적 그림과 함께 단계별 지침을 제공합니다.

초록

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대식세포는 가장 중요한 항원 제시 세포 중 하나입니다. 대식세포의 많은 부분 집합은 고유한 대사 신호로 확인되었습니다. 대식세포는 일반적으로 M1 유사(염증성) 및 M2 유사(항염증성) 아형으로 분류됩니다. M1 유사 대식세포는 LPS 및/또는 INF-γ, IL-12 및 IL-2와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 활성화되는 전염증성 대식세포입니다. M1과 유사한 편광 대식세포는 다양한 박테리아와 바이러스에 대한 숙주의 방어를 매개하여 다양한 질병에 관여합니다. 이는 염증성 질환에서 LPS에 의해 유발된 M1 유사 대식세포와 그 대사 상태를 연구하는 데 매우 중요합니다. M2 유사 대식세포는 항염증성 대식세포로 간주되며, 항염증성 사이토카인과 자극제에 의해 활성화됩니다. 전염증성 상태에서 대식세포는 해당작용 기능에서 해당작용이 증가한 것으로 나타납니다. 해당작용은 세포외 플럭스(XF) 분석기를 사용하여 해당과정, 해당작용 용량, 해당작용 예비력, 보상적 해당작용 또는 비해당계열 산성화의 맥락에서 활발하게 조사되었습니다.

이 논문은 골수 유래 대식세포(BMDM)가 에너지를 호흡하고, 소비하고, 생산할 때 따라하기 쉬운 단계를 통해 해당작용 상태를 실시간으로 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜에서 해당작용의 특정 억제제 및 활성화제를 사용하여 세포의 해당작용 대사 과정에 대한 체계적이고 완전한 관점을 얻고 보다 정확하고 현실적인 결과를 제공하는 방법을 보여줍니다. 여러 해당작용 표현형을 측정할 수 있도록 BMDM의 분극 평가를 위한 쉽고 민감한 DNA 기반 정규화 방법을 제공합니다. BMDM의 표현형 및 대사 상태의 배양, 활성화/분극 및 식별은 다양한 유형의 질병을 조사하는 데 도움이 될 수 있는 중요한 기술입니다.

이 논문에서는 LPS 및 IL4를 사용하여 나이브 M0 대식세포를 M1 유사 및 M2 유사 대식세포로 편광하고, 세포외 플럭스 분석과 해당작용 활성제 및 억제제를 사용하여 시간이 지남에 따라 BMDM의 포괄적인 해당세포 매개변수 세트를 측정했습니다.

서론

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대식세포는 M1과 유사한 선천면역 체계에서 가장 중요한 세포 중 하나입니다. 그들은 감염병, 식균작용, 항원 제시 및 염증 조절2를 제거하는 데 관여합니다. 또한, 대식세포는 대식세포가 방출하는 다양한 사이토카인을 통해 다른 면역 세포를 조절하는 데 필요합니다3. 대식세포 표현형에는 큰 스펙트럼이 있습니다4. 대식세포가 노출되는 신호에 따라 대식세포는 서로 다른 염증 및 대사 상태로 양극화됩니다5. 대식세포는 대식세포가 어떤 조직에 있느냐에 따라 다양한 질병에서 대사 변화를 일으킨다6. 편광 대식세포는 해당작용 대사, 지질 대사, 아미노산 대사 및 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS)를 재프로그래밍하거나 전환할 수 있는 능력이 있습니다7,8. 고전적으로 활성화된 M1 유사 대식세포와 대안적으로 활성화된 M2 유사 대식세포는 대식세포의 가장 많이 연구된 두 가지 표현형입니다3....

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프로토콜

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쥐는 AAALAC(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 및 AALAS(American Association for Laboratory Animal Science) 지침에 따라 Texas A&M University 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 인도적으로 희생되었습니다.

1. 생쥐 골수 채취 및 BMDM 배양

  1. 생쥐(생후 6-10주령 C57Bl/6 생쥐가 이 프로토콜에 포함됨)를 희생하고 복부에 눕히고 피부와 복막층을 자르고 다리를 부드럽게 떼어냅니다.
    알림: CO2 가스 노출을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
  2. 뼈가 잘리지 않도록 주의하면서 양쪽 뒷다리를 엉덩이 아래로 분리하십시오.
  3. 얼음 위에 다리 전체를 50mL 원뿔형 튜브(나중에 쉽게 잡을 수 있도록 발이 위를 향함)에 넣고 마우스에서 두 다리를 채취합니다.

2. 대퇴골 노출

참고: 생물 안전 작업대에서 다음 단계를 수행하십시오.

  1. 각 다리에서 경골을 잘라내어 대퇴골을 적출하고....

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결과

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해당과정(glycolysis)과 미토콘드리아 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)는 세포의 두 가지 주요 ATP 생산 경로입니다(그림 4A). 일부 세포는 에너지 수요를 충족하기 위해 이 두 경로 사이를 전환할 수 있는 능력이 있습니다. 세포질에서 포도당이 피루브산으로 전환되는 것을 해당작용(glycolysis)이라고 합니다. 피루브산에는 두 가지 운명이 있습니다. 그것은 젖산으로 전환되거나 TCA 회로를 통해 그리고 결국 전자 전달 사슬(ETC)을 통해 더 많은 ATP를 생성하기 위해 추가로 대사됩니다. 세포의 해당작용 매개변수를 가장 잘 이해하기 위해 미토콘드리아 ATP 합성효소의 억제제인 올리고마이신을 사용하여 OXPHOS 경로를 최소화합니다. 또한 Rot/AA를 주입하여 ETC를 완전히 차단하고 세포의 최대 해당작용 능력과 보상적 해당과정을 평가합니다(

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토론

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앞서 언급했듯이 세포외 플럭스 분석기는 미토콘드리아 OXPHOS 활성의 지표인 OCR(산소 소비율)과 해당작용의 지표인 ECAR(세포외 산성화율)을 측정하여 세포의 두 가지 주요 에너지 생산 경로에 대한 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 대식세포는 미세환경에 따라 두 경로를 모두 사용할 수 있습니다. 또한 에너지 생산 경로를 전환할 수 있습니다17,18. 대식세포의 에너지 상태와 다양한 약물, 사이토카인, 억제제, 활성제 등에 대한 대식세포의 반응을 이해하면 이러한 세포의 대사 상태를 더 잘 이해할 수 있습니다. 해당과정은 M1 유사 대식세포에서 활성화되는 가장 중요한 경로 중 하나이기 때문에 실시간 해당작용 관련 정보는 다양한 in vitro 조건에서 M1 유사 편광 BMDM의 변화를 추적하는 데 도움이 될 수 있습니다19

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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편집 지원에 대해 Joanna Rocha 씨에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 R01DK118334(Sun 박사와 Alaniz 박사에게) 및 NIH) R01A11064Z(Jayaraman 박사와 Alaniz 박사에게)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
23G 바늘VWRBD305145
2-메르캅토에탄올Life Technologies21985023
50ml 원뿔형 튜브VWR21008-951
ACK 용해 버퍼Thermo Fisher ScientificA1049201실험실에서 만든
Agilent Seahorse XF 해당작용 스트레스 테스트 키트Agilent Technologies103020-100
Agilent Seahorse XF 해당과정 스트레스 테스트 키트 사용자 안내서Agilent Technologies103020-400
Agilent Seahorse XF 해당과정 속도 분석 키트Agilent Technologies103344-100
Agilent Seahorse XF 해당과정 속도 분석 키트 사용자 안내서Agilent Technologies103344-100
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD206(MMR) 항체BioLegend141710
안티-마우스 CD11b eFluor450 100ugeBioscience48-0112-82
BD 3ML - SYRINGEVWR다른 주사기도 허용됩니다
Cell counter-Vi-CELL- XR Complete SystemBECKMAN COULTER Life Sciences731050세포도 수동으로 계수할 수 있습니다.
Cell Strainer-70µ mVWR10199-656
CyQUANT 세포 증식 분석 키트Thermo Fisher ScientificC7026
F4/80 단클론 항체(BM8) pe-Cyanine7eBioscience25-4801-82
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-044
유세포 분석기: BD LSFRFortessa X-20BD656385
Kim WipesVWR82003-822
LPS-SM 초순수(tlrl-smpls) 5mgInvivogentlrl-smlps
MCSFPeprotech315-02
Murine IL-4Peprotech214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38BD Biosciences553764
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Life Technologies15140122
페트리 접시 100mm x 15mmFisher ScientificF80875712
RPMI, 글루타맥스, HEPESInvitrogen72400-120
Seahorse Calibrant 솔루션Agilent Technologies103059-000
Seahorse XF 200mM 글루타민 솔루션Agilent Technologies103579-100
Seahorse XF 해당작용률 분석 키트Agilent Technologies103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaks애질런트 기술102416-100
XF 해당과정 스트레스 테스트 키트Agilent Technologies103020-100
XF RPMI 매체, pH 7.4, 페놀이 없음 RedAgilent Technologies103336-100
BD309657 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 13 (1), (2020).
  2. Martinez-Pomares, L., Gordon, S. The Autoimmune Diseases. , Elsevier. 191-212 (2020).
  3. Orecchioni, M., G....

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재인쇄 및 허가

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태그

Bone Marrow Derived MacrophagesM1 like Macrophage PolarizationM2 like Macrophage PolarizationGlycolytic CharacterizationExtracellular Flux AnalysisDNA based NormalizationMacrophage Culture ProtocolLPS ActivationIL4 StimulationMetabolic Phenotyping
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