방법 논문

오키테 바이트로피화를 통한 불임 보존: 임상 및 실험실 관점

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DOI:

10.3791/61963

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2021년 9월 16일

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1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

이 논문에서

요약

Oocyte 냉동 보존은 후구형 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 적절한 임상 및 실험실 전략은 불임 보존 치료의 효능, 효율성 및 안전을 최대한 보장합니다.

초록

여성의 불임 을 보존하는 것은 환자의 미래의 삶의 질을 돌보는 다기능 의료 시스템에서 중요합니다. Oocyte 냉동 보존은 의료 및 비 의학 표시 모두에 대한 후구 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 주요 의학적 징후는 종양학 질환, 심한 자궁내막증과 같은 부인과 질환, 난소 보호구역을 손상시키는 전신 질환 및 조기 폐경과 관련된 유전적 상태입니다. 이 논문은 객관적이고 증거 기반 상담을 위한 권고사항을 요약하여 불임 보존 치료의 전체 임상 및 실험실 작동을 설명합니다. 또한 절차의 효과에 중점을 두고 난소 예비를 완전히 활용하고 가능한 한 짧은 시간에 검색된 난소 세포의 수를 최대화하는 가장 적절한 전략을 설명합니다. 난소 예비의 평가, 이상적인 자극 프로토콜의 정의뿐만 아니라 난소 검색, 비하 및 유리화 절차는 효능, 효율성 및 안전을 극대화하는 접근 방식과 함께 상세합니다.

서론

인간 난모세포에 대한 효율적인 냉동 보존 프로그램의 개발 및 구현은 생식 의학에서 중요한 돌파구였습니다. 최근 증거에 따르면, 유리화는 환자 집단(불임 환자 또는 난소세포 기증 프로그램)1,2,3과는 독립적으로 느린 동결에 비해 통계적으로 더 높은 생존율을 초래하기 때문에 전이형 II(MII) 난소류를 보존하는 가장 효과적인 전략이다. oocyte 진동의 놀라운 성과는 미국 생식 의학 학회 (ASRM)와 보조 생식 기술 협회 (SART)의 실천위원회가 후구 여성의 선택적 불임 보존에 가장 효과적이도록 발음하도록 이끌었습니다4,5,6. 불임 보존을 위한 의학 표시는 (i) 방사선 요법, 세포독성 화학요법 및 내분비 치료 (난소 예비에 해로운 효력이 모계 나이뿐만 아니라 치료의 유형 및 복용량과 연관되는) 와같은 치료를 필요로하는 (i) 암 및 자가 면역 질환을 포함합니다. (ii) 반복 또는 급진적 인 수술을 필요로하는 난소 질환 (자궁 내막증등)8; 및 (iii) 유전 적 상태 (예를 들어, X 연약) 또는 조기 난소 실패. 또한, 불임 보존은 비 의학적 이유 (사회적 동결로 도상)에 대한 부모의 목표를 달성하지 않은 모든 여성에게 가치있는 옵션이되었습니다.

불임 보존에 대한 표시와 불임 보존에 대한 주요 국제 지침에 따라, 그들의 난모세포에 대한 주요 국제 지침에 따라, 그들의 난모세포에 대한 모든 환자는 절차9,10,11,12,13의성공의 현실적인 기회, 비용, 위험 및 제한에 대해 통보할 적절한 상담을 받아야한다. 가장 중요한 것은, MII 난모세포의 코호트를 진동하는 것은 임신을 보장하지 않지만, 필요한 경우 체외 수정 (IVF) 치료에 미래의 성공의 더 높은 기회를 제공한다는 것을 분명히해야한다14. 이와 관련하여, 난낭체 진동시의 여성의 나이는 확실히 가장 중요한 제한 요인15 고급 모성 연령으로 (AMA; >35 년) 여성 불임의 주요원인이다 16. 난소 예비의 점진적 감소 외에, AMA는 신진 대사, 후성 유전학 조절, 세포 주기 체크포인트 및 메이오틱 분리17과같은 불완전한 생리적 경로로 인한 난소 세포의 능력의 손상과 관련이 있다. 따라서, 생체화하는 계란의 적당한 수는 주로 모성 나이에 달려 있습니다. 36 세 미만의 여성의 경우 성공 가능성을 최대화하기 위해 적어도 8-10 MII 난모세포18이 필요합니다. 일반적으로, 유리화 된 난모세포의 수가 높을수록 성공 가능성이 높습니다. 따라서, 항 뮐레리안 호르몬(AMH) 수준 또는 개미 여포 수(AFC)와 같은 난소 예비 마커에 따라 난소 자극을 조정하는 것은 가능한 한 짧은 시간에 난소 예비군을 완전히 활용하는 데 매우 중요합니다.

전체 절차의 안전은 불임 보존을 위해 환자를 등록할 때 다른 중요한 문제입니다. 임상의는 위험을 최소화하고 예방 (i)난소 과자극 증후군 (OHSS)을 방지하기 위해 최선의 전략을 채택해야 합니다 고나돌트로핀 방출 호르몬 (GnRH) 길항제 프로토콜과 같은 안전한 접근 법을 사용하여 GnRH 작용기 트리거19 및 (ii) 원격, 그러나 가능한, 복막 출혈의 위험, 골반 구조에 부상 (요관, 창자, 부록, 신경), 또는 oocyte 검색 하는 동안 골반 감염. 마지막으로, (iii) 자극을 위한 전통적인 식이요법은 초생리학적 혈청 estradiol과 연관되어 있기 때문에 유방암과 같은 에스트로겐 에스트로겐 에스트로겐 에민감한 질병에서는 권장되지 않습니다. 아로마타제 억제제(예: 레토졸 또는 타목시펜)를 포함하는 프로토콜은 이러한 경우20,21에서더 적합하다. 실험실 설정에서, oocyte 진동을 위한 가장 널리 퍼진 프로토콜은 여전히 Kuwayama와동료에의해 기술된 첫번째2,23입니다,극저온 보호제 (CPA)의 점진적인 추가를 관련시키는 단계적 절차로 이루어져 있습니다. 제1상(평형/탈수)에서, 난모세포는 7.5% v/v 에틸렌 글리콜 및 7.5% v 디메틸 설프리산화물(DMSO)을 함유한 CPA 용액에 노출되며, 2상에서는, 난소세포는 15% v/v 에틸렌 글리콜과 15% v/v DMSO, 0.5 mol/L 자당으로 바이트화 용액으로 이동됩니다. 생체화 의 매체에서 짧은 배양 후, 난소 세포는 특별히 설계, 열 극저온 장치에 배치하고 마지막으로 사용 될 때까지 저장 - 196 °C에서 액체 질소에 급락 할 수 있습니다.

여기서, 불임 보존 치료의 전체 임상 및 실험실 작업업은 (i) 객관적이고 증거 기반 상담을 위한 권고사항을 요약하고, (ii) 절차의 비용 효과에 초점을 맞추고, (iii) 난소 예비를 완전히 활용하고 가능한 한 짧은 시간에 회수된 난소 세포의 수를 최대화하는 가장 적합한 전략을 설명하는 것으로 설명하였다. 난소 예비의 평가, 이상적인 자극 프로토콜의 정의뿐만 아니라 난소 검색, 비하 및 유리화 절차는 효능, 효율성 및 안전을 극대화하는 접근 방식과 함께 자세히 설명될 것입니다. 이 프로토콜의 다른 프로토콜 또는 적응이 문헌에 존재하므로 이 원고의 대표 결과 및 토론 섹션은 이 절차에만 적용됩니다.

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프로토콜

1. 업무 및 임상 상담

참고: 종양학적 이유로 불임 보존을 요구하는 환자의 경우, 일정 상담을 위한 대기자 명단이 없는지 확인하고 가능한 한 빨리 약속이 제공됩니다.

  1. 병력 및 이전 문서를 검사하고 환자의 전반적인 건강 상태를 평가합니다.
  2. 관계형 데이터베이스에 모든 정보(암 환자의 경우 난소 자극을 받기 위한 종양 전문의의 승인 포함)를 기록합니다.
  3. 환자에게 절차의 타당성에 대한 구체적인 상담을 제공합니다. 절차의 단계 (난소 자극, 난소 처리 검색, oocyte vitrification)를 설명하고, 성공의 현실적인 기회에 대해 그녀에게 알려 (주로 모성 나이및 oocyte 검색 시 MII 난마세포의 예상 수에 따라 달라), 절차의 비용과 한계.
  4. 난소 보호구역(즉, AFC)에 대한 정보를 얻고 계란 수집을 위한 난소의 접근성을 평가하기 위해 질 초음파를 수행합니다.
  5. 혈액그룹과 류서인자, 응고 스크리닝(혈액수, 프로트롬빈, 혈전세포증, 피브리노겐, 단백질 C, 단백질 S, 항혈암비III, 호모시스테인), 및 전염병(B형 간염, C형 간염, HIV, 정맥암병 연구소/Treponemapallidum Hemagis)를 평가하도록 혈액 검사를 요청합니다.
    참고: 비 긴급한 의학적 이유로 불임 보존 프로그램에 접근하는 환자의 경우, 보다 포괄적인 평가에는 기저 여포 자극 호르몬(FSH), 루테인화 호르몬(LH), 에스트라디올, AMH, 유방 검사, 파파니콜라우 검사, 응고의 유전자 검진(레이덴 및 프롬빈의 인자 V), 및 토치(세포바이러스) 및 스토치(세포바이러스)가 포함될 수 있습니다.
  6. 심장 검사(심전도)를 요청하십시오.
  7. 심리 상담을 추천합니다.

2. 불임 보존을 위한 통제된 난소 자극 프로토콜

참고: 암 치료를 시작하기 전에 사용할 수 있는 시간이 제한되면, 임의 시작 프로토콜(즉, 생리주기 동안 언제든지 난소 자극시작)은 불임 보존 후보인 종양학 환자의 난소 자극에 권장됩니다. 비긴급한 의학적 이유 또는 사회적 이유로 불임 보존 프로그램에서, 초기 여포 단계에서 시작되는 기존의 자극이 바람직하며, 난소 자극은 생리주기에 기초하여 시작된다. 통제된 난소 자극 (COS) 접근은 인간 재생산과 발생학의 최근 유럽 사회에 따라 수행되어야 합니다 (ESHRE) 지침24.

  1. 환자의 특성과 난소 예비 마커에 따라 COS를 조정, 주로 모성 나이, FSH, AMH, 및 AFC.
  2. 150-300 IU/일의 고정 용량으로 재조합 또는 오줌 FSH를 사용하여 생리 주기의 5 일째에 COS를 시작합니다 (길항 프로토콜).
    참고: LH 결핍 또는 비최적 반응이 없는 특정 환자 집단에서는 난소 반응, LH 수준 및 산부인과 의사의 판단에 따라 LH 75/150 IU/day를 추가로 투여할 수 있습니다.
  3. 에스트로겐에 민감한 질병을 가진 환자에서는, 난소 제거 후에 7 일까지 자극의 1 일에서 aromatase 억제제 (letrozole)와 관련되었던 생식선 호르몬을 포함합니다.
  4. 4 일 동안 생식선 호르몬의 고정 된 복용량을 관리.
  5. 5일째에 여포 성장을 모니터링한 다음 2-3일마다 모니터링합니다. 결국, 생식 샘 호르몬 복용량을 조정.
  6. 일단 적어도 3 여포직경 17-18 mm에 도달하면, 0.5 mL의 복용량에 GnRH 작용제의 단일 피하 볼루스와 최종 난소 세포 성숙을 위한 트리거를 관리합니다.

3. 오사이클 리트리버

  1. 난소 검색 준비
    1. 필요한 재료의 경우, 재료의 테이블을참조하고, 준비 실험실 신발과 의상, 수술 용 면 마스크, 헤어 커버, 수술 장갑, 영구 무독성 마커, 핀셋, 멸균 작은 거즈, 일회용 또는 재사용 가능한 speculum, 질 수술 장비 및 표면 소독제를 유지합니다. 소생 장비, 반전을 위한 마취제, 아나필락시성 쇼크 치료를 위해 준비된 키트, 수술실에서산소의 가용성을 보장합니다.
    2. 보조 생식 기술(ART)25에서초음파에 대한 ESHRE 워킹 그룹의 권고에 따라 난소 화물 회수 절차를 수행한다.
      1. 예방을 위한 식증 또는 전신 마취 및 항생제를 관리하십시오.
        참고 : 이 프로토콜에서, 깊은 체양은 프로포폴 (환자의 체중에 따라 투여량이 조정되는) 및 펜타닐의 50-100 μg, 1000 mg의 파라세타몰 및 산소로 보조 마스크 환기를 관리함으로써 달성되었습니다.
      2. 진공 펌프, 17G 단일 루멘 바늘에 연결된 수집 튜브 및 난소 세포 수집 튜브로 구성된 흡인 유닛을 사용하여 난소 리찰을 수행합니다. 수집 하는 동안, 적혈구를 벗겨 또는 zona 펠루치다를 골절 등 난모 세포의 손상의 위험을 피하기 위해 ~120 mmHg의 압력을 초과 하지 마십시오.
      3. 작업 표면 온도를 보정하여 배양 매체에서 37°C를 보장합니다. 전체 절차 동안 발달 능력에 영향을 줄 수 있는 일시적인 온도에도 난구노출을 최소화합니다.
      4. 난동성 검색의 끝에서, 방전하기 전에 3-4 시간 동안 환자를 관찰한다.
  2. 운영 극장
    1. 수술실에 들어가기 전에 환자를 식별하고 배란 트리거 시간을 확인합니다.
    2. 환자가 부인과 위치에서 수술대에 누워 있다.
    3. 세균 오염을 최소화하기 위해 난소 제거 전에 질 /자궁 경부를 정화합니다.
    4. 다양한 장기 및 혈관과의 난소 및 해부학 적 관계의 위치를 평가하기 위해 예비 질 초음파를 수행하십시오.
    5. 초음파 지침에 따라, 질 벽을 통해 난소 여포에 단일 루멘 바늘을 삽입, 질 벽과 난소 사이에있는 장기 또는 혈관을 다치게하지 않도록주의.
    6. 가장 가까운 여포에서 포부를 시작하고 가장 단면으로 이동합니다.
    7. 11-12mm보다 큰 직경의 모든 여포를 천자하여 바늘의 "비틀기 움직임"을 수행하여 전체 여포 액을 흡인시킨 다음 수술실의 블록 히터에서 예열된 멸균 튜브(원형 하단 14mL)로 방출됩니다.
    8. 검색 직후 환자의 신원에 대한 세부 사항으로 튜브를 밀봉하고 라벨을 부착하십시오.
    9. 간호사가 튜브를 실험실로 가져와야하며, 여기서 즉시 적수-난낭 복합체(COC)의 존재를 위해 가려져 있는지 확인하십시오.
    10. 배아학자들에게 검색된 COC의 총 수에 대해 임상의에게 알리라고 지시한다.
    11. 첫 번째 난소에 대한 절차가 완료되면 깨끗한 배지로 바늘을 플러시하고 동일한 절차를 사용하여 두 번째 난소로 진행합니다.
    12. 난소 검색 후, 파라메륨의 난소 또는 혈관에서 출혈과 더글러스의 파우치에 있는 액체를 평가하십시오.
      참고: 임상 수준에서 게임테 및 배아 추적성의 효과를 자동화하고 개선하기 위해,중앙(26)에서전자 목격 시스템(EWS)이 구현되었다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 어떤 IVF 실험실에서 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 EWS를 언급하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 절차의 모든 단계는 게임테 및 배아 추적성을 보장하기 위해 두 번째 연산자 (즉 증인)가 필요하다는 것을 고려하십시오.

4. IVF 실험실

  1. 난막화물 검색 절차 전날
    1. 난구 수집 튜브를 준비합니다(재료표참조).
      1. 각 난소량 수집 튜브(원형 바닥, 5mL)에서 IVF 배지 1mL(재료의 표참조)를 분배하고, 배아 배양을 위한 0.2mL의 미네랄 오일(재료표참조)으로 커버한다.
        참고: 튜브 수는 회수될 것으로 예상되는 여포 수에 따라 정의됩니다. 각 튜브에는 최대 4개의 COC가 포함될 수 있습니다.
    2. 캡(첫 번째 스냅)으로 튜브를 밀봉합니다. 중간 유형과 준비 날짜의 세부 사항으로 튜브에 라벨을 지정합니다. 제어 된 분위기 (6 % CO2,5 % 02)에서37 °C에서 하룻밤 동안 튜브를 배양합니다.
  2. 난소 화물 검색 당일
    1. 플라스틱 소모품을 37°C(멸균 배양 접시 및 파스퇴르 파이펫)로 미리 데우습니다.
    2. 환자에게 자신의 신원 (전체 이름과 생년월일)과 배란 트리거의 시간을 확인하도록 요청하십시오. 검사장에 식별(ID) 절차가 완료되었으며 배란 트리거 의 시간이 확인되었다는 것을 진단합니다.
    3. 오사이클 수집 튜브를 인큐베이터에서 꺼내서(절차가 시작되기 직전에) 캡을 밀어 밀어 단단히 닫습니다. 난낭 수집 튜브에 환자의 정보를 라벨로 지정합니다. 난낭 수집 튜브를 블록 히터에 37°C로 놓습니다.
    4. 예온멸균 배양접시에서 여포액을 검사하고 COC를 식별합니다. 하나 이상의 COC가 확인되면, 여포액과 혈액 오염을 제거하기 위해 중간 두 방울로 두 번 헹구십시오.
    5. COC를 난소 수집 튜브로 옮기고 튜브의 COC 수에 추가됩니다. 중간 튜브의 캡을 느슨하게하고 6 % CO2,5 % O2의분위기에서 37 °C에서 신속하게 배양하십시오.
    6. 검색된 난모세포의 수에 따라 7~9단계를 반복합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.
      참고: 증인이 모든 튜브 온난화 블록(작동 극장의 블록 포함)이 비어 있는지 확인하고 실험실 시트의 절차 종료에 서명합니다.
    7. 절차가 완료된 후 작업 단계를 지워보냅니다.

5. 오사이클리 비하

  1. Prewarm 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)-완충된 배지 및 히알루로니다제(재료의 표참조)는 시작하기 전에 최소 1h로.
  2. 4웰 IVF 플레이트(재료의 표참조)를 0.6mL/웰에 예동된 HEPES 버퍼링 배지(5% 인간 혈청 알부민[HSA]로 보충)로 준비하여 배아 배양을 위한 미네랄 오일0.3mL로 덮여 있고, 37°C에서 30분 이상 따뜻하게 드실 수 있다.
  3. 환자의 정체성에 대한 세부 사항으로 난소 성소 소명 판에 라벨을 부착하십시오.
  4. 시술을 시작하기 직전에, 첫 번째 웰에 히알루로니다아제를 추가하여 약 20 IU/mL의 최종 농도를 얻습니다.
  5. 적혈구를 분산시키는 효소를 함유하는 첫 번째 우물에 제한된 수의 COC(최대 6개)를 배치한다.
  6. 적수와 코로나 세포의 효소 제거를 강화하기 위해 최대 30s의 내직경이 약 250 μm인 파스퇴르 파이펫을 통해 난미세포를 반복적으로 피펫하여 적수 세포의 제거를 수행합니다. 초기 세포 해리가 관찰된 후, 난소세포를 HEPES 버퍼링 배지만 함유하는 제2웰로 이송하여 최소한의 양의 효소를 이월하는 주의를 기울인다.
  7. 내지름(170-145 μm)을 감소시키는 피펫을 데칭하여 코로나 세포를 제거하기 위해 추가 반출을 수행한다. 필요한 경우에만 낮은 직경(135μm)을 사용합니다.
  8. 탈모한 난토를 조심스럽게 씻어 효소를 씻어내세요.
  9. 부인 후, 그들의 무결성과 성숙의 단계를 평가하기 위해 반전 된 현미경의 밑에 난모세포를 검사합니다. 미숙한 것들 (발아 소포 및 메타 상-I)에서 MII 난모를 분리합니다.
  10. MII 난모를 유리화 영역으로 이동하여 냉동 보존을 즉시 수행합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.

6. 오키테 바이트로피화

참고: 난소세포 리원산38h 내및 반출 직후의 난소성 진동을 수행하는 것이 바람직하다. 여기에 설명된 진동 절차는 실온(RT)에서 수행되어야 하며, 조작 시 난모를 손상시키지 않도록 내경 170μm의 스트리퍼 파이펫을 사용하여 달성되어야 한다.

  1. 시술 전에 약 30분, 평형 용액(ES) 및 유리화 용액(VS)을 RT(25-27°C)로 가져온다.
  2. 환자의 이름과 ID, 치료 ID, 동결 날짜, 난모세포 수 및 냉동 고리 코드로 냉동 장치에 적절하게 레이블을 지정합니다.
  3. 일회용 냉각 랙을 신선한 액체 질소로 위로 채우고 멸균 공정을 시작합니다.
  4. 환자의 이름과 ID로 유리화 플레이트(재료 표참조)에 라벨을 부착합니다.
  5. 각 유리병을 두 번 반결하여 사용 전에 내용물의 혼합을 하고, HEPES 버퍼링 된 매체 (5 % HSA)의 30 μL 1 방울과 ES30 μL의 1 방울로 6mm 페트리 접시의 뚜껑을 준비하십시오.
    참고: 중간 증발을 제한하기 위해 사용하기 직전에 방울을 놓습니다.
  6. 170 μm 직경 스트리퍼 파이펫을 사용하여 첫 번째 낙하에 난모세포(최대 9개)를 가능한 가장 작은 부피로 놓습니다. 스트리퍼 파이펫을 사용하여, 낙하 n.1과 n.2 사이의 배지의 다리를 만들어 CPA(도1A)의농도가 점진적으로 증가한다.
  7. 첫 번째 드롭에서 3분간 난미를 배양합니다. ES(n.3)의 30 μL의 세 번째 방울을 추가합니다. 3분 후, 난소세포를 ES의 두 번째 낙하로 옮기고, 낙하 n.3과 n.2(도1B)사이에중간 다리를 만듭니다. 3 분 동안 드롭 n.3에 난모세포를 배양.
  8. 인큐베이션 동안 사용할 각 저온 장치에 대해 30 μL 방울을 추가하십시오(9개의 난낭을 냉동 보존하는 경우 ES 의 각 방울에 3 방울의 ES 방울을 놓습니다). 난모를 순수 ES 용액으로 이동시키고 6-9분 동안 둡니다(수축 후 초기 크기를 복구할 때까지)(그림 1C).
  9. VS 1mL로 중앙 웰 디쉬(60 x 15mm)를 준비합니다. 처음 6분 이내, 난귀체를 VS 용액으로 전송하여 가능한 한 적은 배지를 방출합니다. 난모를 VS에 1분 동안 두고, 아래에서 위로 이동하여 ES의 과잉을 제거하여 조심스럽게 씻으십시오.
  10. 잠복분이 끝나기 전에 약 10초, 냉동장치를 현미경 아래에 놓고 블랙 마크(즉, 극저온 장치의 끝)에 초점을 조정한다. 최소VS(그림 2A)의검은 색 마크 옆에 난미장치를 놓습니다.
  11. 스트리퍼 파이펫을 난모세포로부터 멀리 이동시키고, 난소세포가 중간층(도2C)에의해 덮여 있도록 VS배지(도 2B)의초과를 제거한다.
  12. 액체 질소에 냉동 장치를 빠르게 급락, 빠르게 표면에서 기포를 제거하기 위해 흔들어. 냉동 장치의 보호 캡을 핀셋으로 잡고 액체 질소로 채웁니다. 그런 다음 프로틸렌 스트립을 액체 질소에 보관하면서 냉동 장치를 삽입합니다.
  13. 이전에 환자의 정보로 표시된 visiotube에 냉동 장치를 저장합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.

7. 오사이클 온난화

  1. 시술 전에 약 30분, 해동 용액(TS), 희석용액(DS), 세척용액(WS)을 RT(25-27°C)로 데워주세요. 각 유리병을 두 번 조심스럽게 반전하여 내용을 혼합합니다. 중앙 우물 페트리 접시에 TS 의 1 mL을 배치하고 절차를 시작하기 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 따뜻하게.
  2. 모든 플라스틱 소모품을 환자의 이름과 ID 및 솔루션 유형으로 라벨을 지정합니다. 증인에게 냉동 장치에 대한 환자의 정보를 확인하도록 요청하십시오.
  3. 각 저온 장치를 데우려면 첫 번째 우물에서 200 μL의 DS가 있는 6웰 플레이트와 두 번째 및 세 번째 우물에서 동일한 양의 WS(WS1 및 WS2라고 명명됨)를 준비합니다. 인산염 완충식식염(PBS) 또는 멸균수를 우물 외부 부위에 첨가하여 증발을 방지합니다.
  4. 인큐베이터에서 TS 접시를 꺼내 현미경 아래에 놓습니다. 현미경의 초점을 페트리 접시의 중심으로 조정합니다.
  5. 프로틸렌 스트립을 액체 질소에 보관하면서 극저온 장치의 보호 캡을 조심스럽게 비틀고 제거합니다. 냉동 질소에서 TS로 극저온 장치를 가능한 한 빨리 전송하여 탈착 위험을 피하고 카운트다운(1분)을 시작합니다.
  6. 냉동 장치 끝(즉, 검은 자국)에 초점을 맞추어 난모를 국한합니다. 스트리퍼 파이펫을 사용하여 냉동 장치에서 난모를 놓습니다.
    참고 : 냉동 장치에서 난모를 흡인하지 않으려고; TS로 이동할 때까지 일부 미디어를 부드럽게 공개합니다.
  7. 170 μm 직경 스트리퍼 파이펫을 사용하여, 약간의 양의 TS (그라데이션을 만들기 위해)로 오사이클을 DS로 전송하고 3 분 동안 DS에 둡니다. 난모를 WS1로 이동하여 5분 동안 둡니다. 마지막으로, 1 분 동안 WS2로 난모를 전송합니다.
  8. 난소체를 적절한 선형화 된 IVF 배양 매체로 옮기고, 내트라피토프라심 정자 주입 (ICSI)을 진행하기 전에 1 시간 동안 배양하십시오. 실험실 시트를 업데이트합니다.

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결과

센터의 불임 보존 프로그램 개요

12년 기간(2008-2020년) 동안 285명의 여성이 수집된 성숙한 계란의 전체 코호트의 병용을 수반하는 적어도 하나의 난낭화물 검색을 시행했습니다. 이들 여성의 대부분(n=250)은 단일 검색을 거쳤으며 35명이 여러 번 검색을 거쳤습니다. 계란 유리화에 대한 난소 세포 검색을 받는 이유는 의료 (암 제외), 암, 비 의료 및 기타 4 가지 범주로 요약됩니다. 계란 유리화를 위한 단 하나 난낭 검색을 겪고 있는 250명의 여자 중, 8%는 암 이외의 의학적 이유가 있었습니다 (10 자궁내막증, 3명의 근종, 4개의 난소 낭종, 1하이드로살핀스), 16%는 암 (31유방암, 3개의 난소암, 2개의 대장암, 2호지킨 림프종, 1vgkin의 림프종, 1vvar 암 e 1 자궁 경부암), 53%는 비의 이유가 있고, 23%는 그밖 이유를 가지고 있었습니다 (43의 결석, 10S) 및 10S 감염에 대한 그밖 이유가 있었...

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토론

임상 고려 사항

난소 조직 냉동 보존 및 체외 성숙과 같은 새로운 전략이 탐구되었지만 COS 후 난소 의 진동은 불임 보존을위한 금 표준 기술입니다. 이 시나리오에서는 대부분의 암 환자가 암 치료를 시작하기 전에 한 난소 주기에서만 이익을 얻을 수 있기 때문에 검색되고 냉동 보존된 난모세포의 수를 가능한 한 짧은 시간에 최대화해야 합니다. 따라서, 적절한 난소 자극 프로토콜은 난소 예비를 완전히 활용하고 미래의 살아있는 출생28의누적 기회를 증가시키는 것이 중요합니다. 이와 관련하여, 불임 보존 목적을 위한 난낭성 진동에 대한 이상적인 연령은 아직29세이며,35세18세 또는37세 30세,31년사이에 합의가 필요하다. ...

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Lab MarkersSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
StereomicroscopeLeicaLeica M80
온도계
시험관 워머
트라이 가스 인큐베이터PanasonicMCO-5M-PE02 / CO2
진공 펌프CookK-MAR-5200
< >< strong > 소모품 < / strong >< / u >
CSCM (Continuos 단일 배양 완료) 매체Fujifilm Irvine Scientific90165HSA 미네랄 오일이 보충된 IVF 배양 배지
Fujifilm Irvine Scientific9305
난자 흡인 바늘(단일 루멘)CookK-OSN-1730-B-60
Primaria 접시코닝353803Corning Primaria 접시 100x20mm 스타일 표준 세포 배양 접시
둥근 바닥 튜브팔콘352001Falcon 14ml 라운드 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브 스냅 캡 라운드
- 바닥 튜브Falcon352003난자 수집 튜브 / Falcon 5ml 12x75 라운드 바닥 Polipropilene 테스트 튜브 스냅 캡 고무
전구 SigmaAldrichZ111589-12EA
멸균 유리 파스퇴르 피펫Hunter ScientificPPB150-100PL피펫 파스퇴르 Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 인큐베이터EppendorfGalaxy 14S
Flexipet 조절 가능한 핸들 세트CookG18674스트리퍼 홀더
Gilson PipetmanGilson66003p20
k-시스템 인큐베이터CoopersurgicalG210Invicell
Lab 마커Sigma Aldrich
층류 후드IVF TECH등급 A 기류
실체현미경Leica LeicaM80
Consumables
Biopur epTIPS 랙Eppendorf30075331마이크로피펫 epTIPS Biopur 2-200 µ l
인간 혈청 알부민thermoFisher Scietific9988
히알루로니다아제후지필름 Irvine Scientific90101히알루로니다아제 효소 80 IU / mL
Corning353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria 표준 세포 배양 접시
IVF 접시 슬라이딩 뚜껑이있는 4 웰 플레이트ThermoFisher Scietific176740Multidish 4 wells (Nunc)
IVF 1웰 디쉬Falcon353653Falcon 60 x 15 mm TC 처리 센터 웰 IVF
배아 배양을 위한 미네랄 오일Fujifilm Irvine Scientific9305
Modified HTF MediumFujifilm Irvine Scientific90126HEPES 완충 매체
고무 전구Sigma AldrichZ111589-12EA1 mL 용 파스퇴르 피
멸균 유리 파스퇴르 피Hunter ScientificPPB150-100PL피펫 파스퇴르 피펫, 150 mm, MEA e CE
스트리핑 피펫  팁 (140 µ m)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
스트리핑 피펫 팁(130 µ m )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
스트리핑 피펫 팁(170 µ m)CookK-FPIP-1170-10BS-5피펫 플렉시펫 당 DENUDING
strong>Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet 조절 가능한 핸들 세트CookG18674스트리퍼  홀더
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
랩 마커Sigma Aldrich
층류 후드IVF TECH등급 A 공기 흐름
냉각 랙용 스테인리스 용기Kitazato유리화용 액체 질소 용기
실체 현미경Leica Leica M80
소모품
Biopur epTIPS 랙Eppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µ L
인간 혈청 알부민Fujifilm Irvine Scientific9988
IVF 배양 접시 (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon 접시 60 x 15 mm TC Primaria 표준 세포 배양 접시
IVF 접시 6-wellOosafeOOPW-SW02OOSAFE  6 웰 디쉬 스트로 홀더
수정 HTF 중간후지필름 Irvine Scientific90126HEPES-Buffered 중간
스트리핑 피펫 팁 (170 &마이크로; m)CookK-FPIP-1170-10BS-5피펫 FLEXIPETS 당
유리화 프리즈 키트후지필름 어바인 사이언티픽90133-soES (평형 용액, 2 x 1 mL) 2 바이알 및 VS (유리화 용액, 2 x 1 mL) 2 바이알
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet 조절 가능한 핸들 세트CookG18674스트리퍼  홀더
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
k-시스템 인큐베이터CoopersurgicalG210Invicell
Lab MarkersSigma Aldrich
층류 후드IVF TECH등급 A 기류
냉각 랙용 스테인리스 용기Kitazato유리화용 액체 질소 용기
실체현미경LeicaLeica M80
소모품
Biopur epTIPS 랙Eppendorf30075331Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µ L
CSCM(Continuos single culture complete) 배지Fujifilm Irvine Scientific90165
IVF 배양 접시가 보충된 IVF 배양 접시(60 x 15mm)Corning353802 Corning Primaria Falcon 접시 60X15mm TC Primaria 표준 세포 배양 접시
IVF 접시 슬라이딩 뚜껑이 있는 4웰 플레이트ThermoFisher Scietific176740Multidish 4웰(Nunc)
IVF 접시 6-웰OosafeOOPW-SW02OOSAFE®   6 WELL DISH WITH STRAW
HOLDER 배아 배양을 위한 미네랄 오일Fujifilm Irvine Scientific9305
SA트립핑 피펫 팁 (300&마이크로; m)CookK-FPIP-1300-10BS-5PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kitFujifilm Irvine Scientific90137-soTS 4바이알(해동 용액, 4 x 2mL) + DS 1바이알(희석 용액, 1 x 2mL) + WS 1바이알(세척액, 1 x 2mL)
배아 배양을 위한 HEPES 완충 HTF IVF 배양 접시 (60 x 15mm)에 펫 펫 < HSA

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