이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍
이 논문에서
요약
초록
근 이영양증에 있는 병리생리학 그리고 치료 표적 둘 다에 대한 조사는 인간 myoblasts의 제한된 증식 능력에 의해 방해되었습니다. 몇몇 마우스 모형은 만들어졌습니다 그러나 그(것)들은 질병의 인간적인 생리병을 진정으로 대표하지 않거나 인간에서 찾아낸 돌연변이의 넓은 스펙트럼의 대표적이지 않습니다. 인간의 기본 근간이 불멸하는 것은 이 한계에 대한 대안이다. 그러나, 그것은 여전히 근육 생검에 의존, 침략 적이 고 쉽게 사용할 수. 대조적으로, 피부 생검은 환자에게 쉽게 얻고 더 적게 침략적입니다. 피부 생검에서 파생된 섬유아세포는 심근세포로 불멸하고 분화될 수 있으며, 우수한 근생잠재력을 가진 세포의 원천을 제공합니다. 여기서는 섬유아세포의 빠르고 직접적인 리프로그래밍 방법을 근생 계보로 설명합니다. 섬유아세포는 두 개의 렌즈피바이러스로 변환됩니다: hTERT는 1차 문화와 테트 유도할 수 없는 MYOD로,독시사이클린을 첨가하면 섬유아세포를 근막세포로 전환한 다음 후기 분화 마커를 표현하는 성숙근투로 변환합니다. 이 빠른 이차 성전환 프로토콜은 병리학 적 메커니즘을 조사하고 신경 근육 장애에 대한 혁신적인 유전자 기반 또는 약리학적 생물 요법을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다.
서론
인간 조직에서 직접 얻은 세포 모델은 원래 게놈 컨텍스트를 갖는 이점과 환자에서 관찰 된 동일한 분자 및 세포 특징을 재현하는 이점으로 많은 인간 유전 질환을 모델링하는 데 유용합니다. 신경 근육 장애의 분야에서, 근육 생검은 인간의 myoblasts의 훌륭한 소스 되었습니다 및 병리학 적 메커니즘의 해명에 도움이 되었습니다. 추가적으로, 그(것)들은 약과 유전자 치료의 생체 내 시험을 위한 중요한 공구입니다. 한편으로는 근육 파편에서 근막의 파생은 비교적 쉽습니다. 한편, 1차 근막의 문화와 유지보수는 시험관 1에서의 제한된 증식율과 복제적 노화로 인해 도전적이다. 이러한 한계에 대한 대안은 인간 텔로머라아제(hTERT) 및/또는사이클린 의존키나아제 4(CDK4)유전자2,3의삽입으로 근막을 불멸시키는 것이며, 골격근의 보존과 함께4. 그럼에도 불구 하 고, 기본 myoblasts의 집착은 여전히 근육 생검에 의존, 환자에 게 단점과 외과 수술, 많은 경우에, 고급 변성에 그들의 근육을 가지고. 따라서, 이들 환자의 근육은 섬유성 및/또는....
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프로토콜
모든 실험과 생검은 전국 아동 병원 기관 검토 위원회의 승인에 따라 관련 기관의 윤리적 규칙에 따라 수행되었다.
1. 진피 섬유아세포 배양의 개시
- 섬유아세포 문화 확립
- 15mL 원내 튜브에서 섬유아세포배지(표 1)의알리쿼트 10mL. 피부 생검은 이 매체에 배치되고 수송되어야 합니다. 생검은 처리될 때까지 4°C로 보관할 수 있으며, 같은 날에 우선적으로 보관할 수 있다.
참고: 오염의 잠재적인 성장을 피하기 위해 24-36 시간 이내에 피부 생검을 사용합니다. - 튜브에서 미디어를 흡습하고 생검을 10mL 1X PBS(실온)로 3회 헹구십시오. 세 번째 세척 후, 튜브에 PBS를 둡니다.
- PBS와 피부를 10cm2 접시에 붓습니다.
- 멸균 메스를 사용하여 생검을 가능한 작은 조각으로 자른다.
- 파이펫을 사용하여 개별 피부 조각을 옮기고 깨끗한 10cm2 접시에 넣습니다. 접시당 10~12개의 조각을 놓습니다.
- 각 조각 주위에서 PBS의 초과를 흡인. 조각을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
- 뚜껑으로 접시를 부분적으로 덮고 피부 조....
- 15mL 원내 튜브에서 섬유아세포배지(표 1)의알리쿼트 10mL. 피부 생검은 이 매체에 배치되고 수송되어야 합니다. 생검은 처리될 때까지 4°C로 보관할 수 있으며, 같은 날에 우선적으로 보관할 수 있다.
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결과
이 프로토콜은 인간의 피부 유래 섬유아세포 배양을 확립하고 근막세포로 변환한 다음 차별화된 근문으로 변환하는 방법을 보여줍니다. 세포주의이 유형은 신경 근육 장애의 연구 와 잠재적인 치료의 체외 테스트에 매우 유용합니다.
섬유아세포 변환의 회로도 표현은 도 1에도시된다. 도 2A는 피부의 파편과 섬유아세포가 그것에서 나오는 것을 보여줍니다. 섬유아세포는 합류에 도달하면 새로운 접시에 전달되어야한다(그림 2B). 도 3A는 독시사이클린으로 보충된 근아세포 성장 매체로 변경하기 전에 섬유아세포의 이상적인 합류를 나타낸다. 세포는 변환 과정에서 여전히 증식하기 때문에 약 70 % 컨실수있어야합니다. 세포가 80% 이상인 경우 분화가 손상될 수 있습니다. 근세.......
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토론
좋은 품질의 FM 셀라인을 얻으려면 몇 가지 단계가 중요합니다. 피부 생검이 빨리 처리될수록 건강한 섬유아세포를 얻을 확률이 높아집니다. 섬유아세포 배양의 통과 수도 중요하다. 1 차 세포는 증식 능력이 제한되어 있으며 많은 구절 후에 복제 노화로 들어갑니다. 따라서, 낮은 통로 수에 섬유아세포의 재고를 가지고 가능한 한 초기 통로에서 세포를 변환하는 것이 좋습니다.
또 다른 중요한 단계는 또한 최대 순도와 정확한 정량화가 있는 바이러스 성 생산을 하는 것입니다. 예를 들어, qPCR을 이용한 바이러스 게놈 정량화는 합리적인 측정을 제공하지만 ddPCR(디지털 물방울 PCR)에 의한 정량화가 더 정확합니다.
또한, myoblast 변환을 위한 섬유아세포의 적당한 합류는 중요합니다. 세포가 70% 이하인 경우 80% 이상이 수렴되면 근생 분화가 손상될 수 있습니다. 세포가 너무 혼잡한 경우에, 염색과 화상 진찰을 방해하는 근사의 .......
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공개 사항
전국 어린이 병원은 Audentes 치료에 여기에 설명 된 엑슨 2 건너 뛰기 프로그램을 허가했다. K.M.F.와 N.W.는 이 라이센스의 결과로 로열티 지급을 받았습니다.
감사의 글
우리는 모델에 대한 과거에 자신의 지식을 공유 빈센트 Mouly 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건국국립신경장애및뇌졸중연구소(R01 NS043264(K01 NS043264,K.M.F.에 의해 지원되고 있다. 및 R.B.W.)), 미국 국립 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M.M, R.N.및 N.W.). N.W.는 오하이오 주립 대학 / 전국 아동 병원 근육 그룹과 필립 재단으로부터 펠로우십 지원을 받았습니다. 이 작품은 또한 내부 임의 기금에 의해 지원되었으며, exon 2 건너 뛰기 작업의 일부는 CureDuchenne (K.M.F.) 및 협회 Francaise Contre 레 Myopathies에 의해 지원되었습니다. IRB 번호: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 및 IBCSC#: IBS00000123.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm 접시 | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, 페놀 레드 | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X 인산염 완충 식염수(PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12웰 플레이트 | Corning | 3513 | |
| 20X 전달 버퍼 | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS 러닝 버퍼 | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 superlabant | Dilution 1:50 |
| 항산화 | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA 단백질 분석 | Thermo Fisher | 23227 | |
| 클로로포름 | 시그마-알드리치 | C2432 | |
| DAPI | 써모 피셔 | D3571 | 희석 1:1000 |
| 디지토닌 | 밀리포어 시그마 | 300410250MG | |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치 | D2438 | |
| DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산 | 써모 피셔 | 10569044 | |
| DNAse I 세트 (250U) | 자이모 리서치 코퍼레이션 | E1010 | |
| 독시사이클린 하이드로클로 | 라이드 피셔 사이언티픽 | BP2653-5 | |
| Dup2 인간 프라이머 | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5 | ' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' | |
| 디스트로핀 항체 | Abcam | ab15277 | 희석 1:200 |
| 소 태아 혈청 | Thermo Fisher | 16000 | |
| 글리신 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| 염소 안티 마우스, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | 희석 1:1000 |
| 중단 프로테아제 억제제 칵테일 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD 염소 안티 토끼 IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | 희석 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 챔버 슬라이드 시스템 | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection 시약 | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스 | Corning | 354230 | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty 냉동 용기 | Thermo Fisher | 51000001 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 0.45 µ m | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat Serum Control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | 웨스턴 블롯 |
| Opti-MEM I 저감 혈청 Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR 마스터 믹스 | Thermo Fisher | K0172 | |
| 포스파타제 억제제 | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid 키트 | 써모 피셔 | K1691 | |
| RNA 클린 & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| 메스 | 아스펜 외과 372611 | ||
| 골격근 세포 분화 매체 | Promocell | C23061 | |
| 골격근 세포 성장 매체 | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros 유기물 | 215682500 | |
| TRIzol 시약 | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| 초저온 냉동고 | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield 퇴색 방지 마운팅 매체 | Vector Labs | H1000 |
참고문헌
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological....
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재인쇄 및 허가
