이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

6.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61991

⸱

2021년 4월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

근 이영양증에 있는 병리생리학 그리고 치료 표적 둘 다에 대한 조사는 인간 myoblasts의 제한된 증식 능력에 의해 방해되었습니다. 몇몇 마우스 모형은 만들어졌습니다 그러나 그(것)들은 질병의 인간적인 생리병을 진정으로 대표하지 않거나 인간에서 찾아낸 돌연변이의 넓은 스펙트럼의 대표적이지 않습니다. 인간의 기본 근간이 불멸하는 것은 이 한계에 대한 대안이다. 그러나, 그것은 여전히 근육 생검에 의존, 침략 적이 고 쉽게 사용할 수. 대조적으로, 피부 생검은 환자에게 쉽게 얻고 더 적게 침략적입니다. 피부 생검에서 파생된 섬유아세포는 심근세포로 불멸하고 분화될 수 있으며, 우수한 근생잠재력을 가진 세포의 원천을 제공합니다. 여기서는 섬유아세포의 빠르고 직접적인 리프로그래밍 방법을 근생 계보로 설명합니다. 섬유아세포는 두 개의 렌즈피바이러스로 변환됩니다: hTERT는 1차 문화와 테트 유도할 수 없는 MYOD로,독시사이클린을 첨가하면 섬유아세포를 근막세포로 전환한 다음 후기 분화 마커를 표현하는 성숙근투로 변환합니다. 이 빠른 이차 성전환 프로토콜은 병리학 적 메커니즘을 조사하고 신경 근육 장애에 대한 혁신적인 유전자 기반 또는 약리학적 생물 요법을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다.

서론

인간 조직에서 직접 얻은 세포 모델은 원래 게놈 컨텍스트를 갖는 이점과 환자에서 관찰 된 동일한 분자 및 세포 특징을 재현하는 이점으로 많은 인간 유전 질환을 모델링하는 데 유용합니다. 신경 근육 장애의 분야에서, 근육 생검은 인간의 myoblasts의 훌륭한 소스 되었습니다 및 병리학 적 메커니즘의 해명에 도움이 되었습니다. 추가적으로, 그(것)들은 약과 유전자 치료의 생체 내 시험을 위한 중요한 공구입니다. 한편으로는 근육 파편에서 근막의 파생은 비교적 쉽습니다. 한편, 1차 근막의 문화와 유지보수는 시험관 1에서의 제한된 증식율과 복제적 노화로 인해 도전적이다. 이러한 한계에 대한 대안은 인간 텔로머라아제(hTERT) 및/또는사이클린 의존키나아제 4(CDK4)유전자2,3의삽입으로 근막을 불멸시키는 것이며, 골격근의 보존과 함께4. 그럼에도 불구 하 고, 기본 myoblasts의 집착은 여전히 근육 생검에 의존, 환자에 게 단점과 외과 수술, 많은 경우에, 고급 변성에 그들의 근육을 가지고. 따라서, 이들 환자의 근육은 섬유성 및/또는 지방 조직의 상당한 비율로 구성되며, 더 적은 근육 세포를 산출하며, 이전에 세포의 정제를 불멸으로 요구한다.

근육 생검과는 달리 피부 생검은 더 접근가능하며 환자에게 덜 해롭습니다. 1 차적인 섬유아세포는 체외에서피부 단편에서 파생될 수 있습니다. 섬유아세포는 신경 근육 장애를 일으키는 돌연변이에 의해 1차적으로 영향을 받지 않더라도, 근막으로 분화될 수 있습니다. 이는 근생 조절인인 5의 Myod 유전자의 삽입에 의해 달성될수 있다. 본 원고에서, 우리는 섬유아세포 배양의 확립에서 차별화된 근로튜브의 고독에 이르기까지, 변형된 근사를 얻기 위한 프로토콜을 설명한다(방법의 대표적인 요약은 도 1에묘사된다).

치료 전략의 전 임상 테스트는 인간 환자에서 발견되는 돌연변이와 유사한 돌연변이를 운반하는 세포 및 동물 모델에 의존합니다. CRISPR/Cas96과같은 유전자 편집 기술의 발전과 함께 동물 모델의 개발이 더욱 실현 가능해졌지만 여전히 도전적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서, 환자 유래 세포주들은 Duchenne 근 이영양증(DMD)과 같은 질병의 돌연변이의 큰 스펙트럼을 커버하는 모형을 갖기 위하여 접근할 수 있는 선택권입니다. 세포 모형의 obtention 그리고 창조는 그 같은 병리를 위한 개인화한 치료의 발달에 중요합니다.

조사 된 개인화 된 치료 중, exon 건너 뛰기 전략은 다른 근 이영양증에 대한 유망한 치료법 중 하나입니다7,8. 이 전략은 짧지만 기능적인 단백질을 생산하는 것으로 구성됩니다. 이것은 스플리케솜에 엑슨 정의를 숨기기 하여 수행되므로 최종 메신저에서 돌연변이된 엑온을 제외합니다. 이것은 DMD에 대 한 FDA에 의해 승인 된 매우 유망한 기술. 따라서, 우리는 또한 이 프로토콜에서 기술, 2개의 다른 엑슨 건너뛰기 관련 기술로 myoblasts를 transfect하는 방법: 안티센스 올리고뉴클레오티드 (AON) 및 U7snRNA-아데노 관련 바이러스 (AAV). AON 트랜스펙트(AON transfection)는 9를 건너뛰는 엑슨을 촉진하기 위해 고안된 여러 시퀀스의 초기 스크리닝을 위한 좋은도구이다. 그러나 AO의 활동은 일시적입니다. 안티센스 서열의 지속적인 발현을 얻기 위해, 우리는 또한 AAV와 결합된 작은 핵 RNA(snRNAs)를 탐구하여 접합 기계10에핵 국소화 및 포함을 허용했습니다. U7은 휘장모가반사시퀀스(11)로리디렉션하고 안티센스 서열을 전달하는 단백질을 결합하도록 설계될 수 있는 히스톤 mRNA의 처리에 관여하는 snRNA이다. AAV 벡터와 함께 수정된 U7 snRNA를 사용하면 AON의 한계를 극복하고 AON의 지속적인 발현과 관심 있는 조직의 더 나은트랜스듀션(12)을생성한다. 우리는 엑슨 건너뛰기 전략을 설명하기 위하여 이 프로토콜을 위해 DMD 환자에게서 파생된 세포를 이용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 실험과 생검은 전국 아동 병원 기관 검토 위원회의 승인에 따라 관련 기관의 윤리적 규칙에 따라 수행되었다.

1. 진피 섬유아세포 배양의 개시

  1. 섬유아세포 문화 확립
    1. 15mL 원내 튜브에서 섬유아세포배지(표 1)의알리쿼트 10mL. 피부 생검은 이 매체에 배치되고 수송되어야 합니다. 생검은 처리될 때까지 4°C로 보관할 수 있으며, 같은 날에 우선적으로 보관할 수 있다.
      참고: 오염의 잠재적인 성장을 피하기 위해 24-36 시간 이내에 피부 생검을 사용합니다.
    2. 튜브에서 미디어를 흡습하고 생검을 10mL 1X PBS(실온)로 3회 헹구십시오. 세 번째 세척 후, 튜브에 PBS를 둡니다.
    3. PBS와 피부를 10cm2 접시에 붓습니다.
    4. 멸균 메스를 사용하여 생검을 가능한 작은 조각으로 자른다.
    5. 파이펫을 사용하여 개별 피부 조각을 옮기고 깨끗한 10cm2 접시에 넣습니다. 접시당 10~12개의 조각을 놓습니다.
    6. 각 조각 주위에서 PBS의 초과를 흡인. 조각을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
    7. 뚜껑으로 접시를 부분적으로 덮고 피부 조각이 5-20 분 동안 건조되도록하십시오. 조각이 과도하게 건조되는 것을 허용하지 마십시오.
    8. 파편이 건조되면 접시를 45도 기울고 천천히 구석에 12 mL의 섬유 아세포 매체를 추가하십시오. 접시를 낮추고 미디어를 조심스럽게 배포하여 파편이 미디어에 의해 들어 올리지 않도록합니다.
    9. 요리를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에넣습니다. 5-7 일, 그리고 일주일에 한 번 후에 미디어를 교체하십시오.
    10. 단편(도 2)에서나오는 섬유아세포를 관찰하고, 일단 컨서블한 후 세포를 75cm2 플라스크로 통과시한다. 매체를 제거하고 PBS로 세포를 헹구고 1 mL 0.25 % 트립신을 추가하십시오. 37°C에서 5분 동안 또는 모든 세포가 들어올릴 때까지 배양합니다. 트립신을 억제하고 새로운 플라스크에 세포를 전송하는 10 mL 섬유 아세포 성장 배지를 추가합니다.
      참고: 통로 번호 명명의 경우, P1은 피부 생검에서 나온 첫 번째 섬유아세포가 증식을 위한 새로운 플라스크로 옮겨질 때 확립됩니다.
  2. 1차 섬유아세포 라인의 냉동 보존
    1. 75cm2 플라스크가 수렴되면 10mL 1X PBS로 헹구고 PBS를 흡인시합니다.
    2. 세포 표면에 0.25 % 트립신의 3 mL을 추가합니다. 플라스크를 인큐베이터에 5분 간 배치합니다. 현미경의 밑에 플라스크를 확인하여 세포가 들어 올려지는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 플라스크를 인큐베이터에 5분 더 놓습니다.
    3. 세포가 분리되면, 파스크와 파이펫에 섬유아세포 매체의 7mL를 넣고 세포를 다시 중단한다. 세포를 50mL 원문 튜브로 수집합니다.
    4. 트라이판 블루의 100 μL 알리쿼트를 준비하고, 냉동 보존 중인 샘플에서 100 μL을 제거하고 트라이팬 블루와 섞습니다. 헤모세포계에 믹스를 적재하여 계산합니다. 현미경의 밑에 혈종계의 4개의 다른 필드에 있는 세포를 계산합니다. 총 셀 수를 계산하려면 수식(셀 계산/100) * 배양 부수를 사용합니다.
    5. 원문 튜브를 300 x g에서 실온 또는 4 °C에서 10 분 동안 회전합니다.
    6. 배지에서 흡인하고 동결 매체의 적절한 부피에서 세포를 재보편성: 각 1백만 개의 세포/유리병당 1mL. 파이펫을 위아래로 위로 하여 1mL를 균일화하고 각 극저온에 분배합니다.
    7. 바이알을 동결 상자에 넣고 바이알이 -80 °C 냉동고에서 1 °C / 분의 속도로 얼도록 합니다.
    8. 다음 날 유리병을 액체 질소 탱크 또는 -150°C 냉동고로 이송한다.

2. 섬유묘세포(FM) 세포주 설립

  1. 다음 날 약 50%의 인플루엔티지를 갖기 위해 12웰 플레이트(2 x 104 세포/웰)의 2개의 우물에서 약 30%의 인플루엔트에서 1차 섬유아세포를 종자한다.
  2. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, 400μL의 헥아스트-푸로마이신 렌즈티바이러스의 2~5 x 109 vg(바이러스 게놈 입자)를 400μL의 섬유아세포 배지에 넣으세요. 두 번째 우물에 섬유아세포 배지의 400 μL만 추가합니다. 다음 날 1mL의 미디어를 추가합니다.
    참고: 렌티바이러스 생산을 위한 플라스미드는 2009년 차우치 외를발행한 그룹에서 입수되었다. 그들은 또한 Aure 외,200713 hTERT 플라스미드 및 Barde 외,200614 에서 MyoD 플라스미드의 설계에 활용된 Tet-on 시스템에 대해 개별적으로 설명된다. 그들은 프랑스 제네톤과 재료 전송 계약 덕분에 얻었다 (이 플라스미드를 얻기 위해 빈센트 물리 박사에게 문의하시기 바랍니다 - vincent.mouly@upmc.fr). 간단히 말해서, hTERT는 CMV 프로모터가 구동하는 hTERT 변종 1로 구성되어 있으며 푸오마이신은 PGK 프로모터에 의해 구동됩니다. MyoD 플라스미드는 억압자 rtTA2의 제어하에 CMV 프로모터에 의해 구동되는 MyoD 변종 1을 포함합니다. 이 플라스미드는 또한 SV40 프로모터 덕분에 표현 된 히그로 마이신 선택을 포함합니다.
    렌티바이러스는 일반 렌티바이러스 생산을 사용하여 생산되었다(왕과 맥마누스 조브 프로토콜15참조). 간단히, MDL 도우미, 레브 도우미, SVS-G 도우미는 또한 hTERT 또는 MyoD 플라스미드의 칼슘 염화 강수량을 통해 전염되었다. 48 h 후, 상체가 수집된 다음 3 일 동안 추가로 수집되었습니다. 모든 상체는 다음 초원심 분리에 의해 농축되었다. 그런 다음 펠릿을 Tris-HCL+NaCl+EDTA 버퍼로 다시 일시 중단했습니다. 티터 추정은 표준 렌티바이러스 qPCR 분석에 의해 평가되었다.
  3. 1~2일 후, 세포를 6웰 플레이트로 옮기고 60-70%의 합류에 도달할 때까지 성장합니다.
  4. 푸오마이신 1μg/mL로 섬유아세포 매체를 보충하고 각 웰에 2mL를 추가합니다.
  5. 제어의 모든 세포가 잘 죽을 때까지 셀을 선택 (최대 12 일), 매 2-3 일마다 미디어를 변경. 6웰 플레이트에서 세포를 2개의 10cm2 접시로 통과하여 추가 증식을 합니다.
  6. 선택 후 섬유 아세포의 유리병을 동결. F(hTer)로 레이블을 지정합니다.
  7. 종자 hTERT 발현 섬유아세포 (F (hTer)는 섬유 아세포 배지에서 약 30 % 합류, 12 웰 플레이트의 두 우물에서, 다음 날 약 50 %의 합류를 갖는다.
  8. 렌티바이러스 트랜스듀션의 경우, 400μl의 섬유아세포 배지에 MyoD-hygromycinB 렌즈바이러스의 2~5 x 109 vg을 혼합하고 각각의 우물에 추가한다. 세 번째 웰에 400 μl 섬유아세포 배지를 추가합니다. 다음날 1mL의 중간 를 추가합니다.
  9. 1~2일 후에 세포를 6웰 플레이트로 옮기고 60-70%까지 자랍니다.
  10. hygromycin B (400 μg/mL)로 섬유아세포 성장 매체를 보충하고 각 우물에 2mL를 추가합니다.
  11. 제어의 모든 세포가 잘 죽을 때까지 셀을 선택 (최대 12 일), 매 2-3 일마다 미디어를 변경.
  12. 선택 후 섬유 아세포의 유리병을 동결. FM으로 레이블을 지정한 다음 셀 식별 번호/이름이 표시됩니다.

3. 과분화 프로토콜

  1. 시드 는 30-40 %의 합류와 함께 10cm2 접시에 FM을 변환. 12웰 플레이트에서 종자 6 x 104 세포(이것은 개별 세포수에 의존).
    참고: 면역 염색의 경우, 종자 세포가 유리 커버립 또는 Matrigel으로 코팅된 챔버 슬라이드에 있습니다. DMEM 매체에서 1:10에 마트리겔을 희석하고 표면을 덮을 수 있을 만큼 부피를 추가하고 슬라이드가 실온에서 1시간 동안 앉을 수 있도록 합니다. 세포를 파종하기 직전에 흡인.
  2. 근막식 유도의 경우 섬유아세포가 70%에도달하면(그림 3A)을입력하고 PBS로 세포 표면을 헹구고 신선한 8 μg/mL 독시사이클린으로 보충된 신선한 myoblast 미디어를 추가합니다.
    참고: 차별화의 성공은 80%의 합류를 통해 손상됩니다.
  3. 2~3일 후, 세포는 90~95%의 컨실레이며, 이들의 형태는 변할것이다(그림 3B). PBS로 세포 표면을 헹구고 신선한 8 μg/mL 독시사이클린으로 보충된 신선한 분화 매체를 추가합니다.
  4. 심근이 확립될 때까지 2-3일마다 미디어를 계속 변경합니다(형태학을 통한 확인)(그림 3C).
  5. 근전비 분화를 시작한 지 7~10일 후에 세포는 완전히 분화되어야 하며 분리되거나 죽을 수 있습니다. 이 일이 발생하기 전에, 추가 분석을 위해 myotubes를 수확.
    참고: 근관 형성의 시간 과정은 세포주에 따라 다릅니다. 근육 관련 단백질에 있는 돌연변이는 근생 잠재력에 방해할 수 있습니다. myotube가 밝게 나타나고 테두리를 하얗게 보이기 시작하면 분리하기 시작하는 신호입니다(그림 4).
  6. 심오튜브를 수확하려면 미디어를 수집하고 50mL 원추형 튜브로 전송합니다. 매체는 분리된 myotube를 포함할 수 있다.
  7. 5mL PBS로 심루튜브를 헹구고 PBS를 50mL 튜브로 옮기습니다.
  8. 세포 표면에 0.25 % 트립신의 3 mL을 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 5분 동안 놓습니다. 현미경의 밑에 접시를 확인하여 세포가 들어 올려지는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 인큐베이터에 5분 이상 다시 놓습니다.
  9. 세포가 분리되면, 접시에 섬유 아세포 매체의 7 mL을 추가하고 세포를 다시 중단하기 위해 위아래로 파이펫. 50 mL 원문 튜브에 세포를 수집합니다.
  10. 원심분리기는 4°C에서 7분 동안 1,200 x g에서 원심분리기.
  11. 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 액체를 흡입합니다. 추가 처리될 때까지 펠릿을 -80°C에 보관하십시오.

4. 차별화된 myotube의 면역스테인링

참고: 면역 염색의 경우 위에서 언급한 것처럼 유리 커버립 또는 챔버 슬라이드에서 세포를 성장시키십시오.

  1. myotube가 완전히 차별화되면 미디어를 흡인하고 PBS로 슬라이드를 조심스럽게 헹구십시오. PBS를 흡입합니다.
  2. 신선한 4% PFA(12웰 플레이트 의 웰당 500 μL)를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 흡입하십시오.
  3. 1 mL PBS로 헹구는 다.
  4. 실온에서 0.2M 글리신으로 10분 동안 배양합니다. 흡입구 글리신 오프.
  5. PBS 0.5% TritonX-100(12웰 플레이트의 300 μL/웰)으로 10분 동안 완만한 교반으로 퍼메아빌라이징합니다.
  6. 300 μL/웰블로 블로킹 용액을 10분 동안 부드럽게 교반합니다.
  7. 1차 항체를 1:50에 희석하여 300 μL의 블로킹 용액으로, 실온에서 2시간 동안 부드러운 흔들림으로 희석합니다.
  8. PBS 1mL/웰 1mL로 5분 동안 3번 헹구고 부드러운 흔들림으로 헹구습니다.
  9. 이차 항체로 1:500을 300 μL의 블로킹 용액으로 1시간 동안 실온에서 부드러운 흔들림으로 희석시켰습니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다.
  10. PBS 1mL/웰 1mL로 5분 동안 3번 헹구고 부드러운 흔들림으로 헹구습니다.
  11. 10 분 동안 PBS에서 희석 DAPI와 인큐베이션. PBS의 1 mL / 웰과 세 번 헹구는.
  12. 유리 슬라이드에 중간 크기의 장착 중간 을 추가합니다. 집게로 커버슬립을 제거하고 장착 매체의 드롭에 엎드립니다.
  13. 종이 타월에 밀어 내고 부드럽게 눌러 거품과 마운팅 매체를 제거합니다.
  14. 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하고 이미징이 될 때까지 4 °C에 보관하십시오.

5. 안티센스 올리고뉴클레오티드 트랜스페션

참고: 아래 프로토콜은 6웰 플레이트의 전환입니다. 더 작거나 더 큰 플레이트에 맞게 볼륨을 조정합니다. 형질전환은 세포가 분화 단계에 대한 준비가 되면 100% 컨실트 근세포에서 수행됩니다.

  1. myoblast 성장 미디어를 흡인하고 1 mL PBS로 세포를 헹구는다.
  2. OptiMEM 미디어의 500 μL/웰을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 옵티메M의 100 μL에서 안티센스 올리고뉴클레오티드(AON)를 원하는 최종 농도(즉, 50nM, 100nM, 200nM, 500nM)로 희석한다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
    참고: 이 프로토콜은 2'omethyl-인포로시아테 AON에 최적화되어 있습니다.
  4. 리포펙타민을 OptiMEM(최종 부피 100 μL)과 혼합하여 최종 비율을 1:1(μg DNA: μL lipofectamine)의 최종 비율을 부여합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
  5. 희석 된 리포펙타민과 희석 된 AON을 결합하십시오. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 20분 동안 배양하여 복잡한 형성을 허용합니다. 기포를 피하십시오.
  6. 리포펙타민과 AON 믹스 200μL를 각 유정에 넣습니다. 세포를 37°C, 5% CO2에서하룻밤 동안 배양한다.
  7. 다음 날 트랜스펙션 믹스를 제거하고 독시사이클린으로 보충된 따뜻한 분화 매체 2mL를 추가합니다.
  8. RNA 추출을 위해 적어도 3일 후에 세포를 수집하거나 단백질 분석의 경우 7~21일 후에 세포를 수집한다.
    참고: RNA 및/또는 단백질 발현을 검출하는 데 필요한 분화일은 관심 유전자 또는 세포주에 따라 달라질 수 있다. DMD의경우 3 일 이내에 mRNA를 감지 할 수 있습니다. Dystrophin 단백질 검출은 적어도 7 일이 필요합니다. 이것은 세포주에 따라 달라집니다. AON 및 경질 시약의 고농도는 전분화에 영향을 미칠 수 있습니다.

6. AAV1-U7 트랜스듀션

참고: 이 프로토콜은 6웰 플레이트에 최적화되었습니다. 배양 표면적에 비례하여 볼륨을 조정합니다. 감산은 세포가 분화 단계에 대한 준비가 되면 100% 컨실트 근세포에서 수행됩니다. AAV1은 배양 된 근종의 최고의 변환 능력을 가진 AAV 혈청형입니다.

  1. myoblast 성장 배지에서 흡인 하 고 1 mL PBS와 세포를 헹구는.
  2. 도산화세포로 보충된 따뜻한 분화 물질의 700 μL에서 AAV1-U7의 0.5-1 x10 11 바이러스 입자를 희석시킵니다.
    참고: 우리는 바이러스 성 농도를 결정하기 위해 qPCR을 사용합니다. 사용할 바이러스의 양은 정량화 방법에 따라 달라질 수 있으며 기자 분석법을 사용하여 이전에 결정되어야 한다.
  3. 균일하게 떨어뜨려 바이러스 성 믹스를 웰에 추가합니다.
  4. 다음 날, 독시사이클린으로 보충된 따뜻한 분화 매체 1.3mL을 추가합니다.
  5. RNA 추출또는 단백질 분석시 7~21일 후에 세포를 수집한다.

7. RNA 추출

참고: 이 단계에서 사용되는 모든 자료는 RNase 가 없어야 합니다.

  1. 펠릿 당 500 μL의 TRIzol을 추가하고 세포를 균일하게 분해되도록 여러 번 파이프를 올다운합니다.
  2. 1.5mL 튜브에서 셀 용양을 옮기고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
  3. 클로로폼 100μL를 넣고 15s를 수동으로 흔들어 줍니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
  4. 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g의 원심분리기. 수성 상(상부 1)을 수집하고 새로운 1.5 mL 튜브로 전송합니다.
  5. 수상 1부량의 경우 1부로 에탄올 100%를 넣고 파이펫팅으로 섞는다.
    참고: 열 정화 및 농도를 권장합니다.
  6. 샘플을 수집 튜브의 Zymo-Spin IC 컬럼으로 옮기고 원심분리기는 30초 동안 12,000 x g로 전달합니다. 흐름을 삭제합니다.
  7. 인컬럼 DNase I 소화의 경우 400 μL RNA 워시 버퍼로 컬럼을 미리 씻으실 수 있습니다. 30 s용 12,000 x g의 원심분리기. 흐름을 삭제합니다.
  8. 샘플 당 DNase 반응 믹스의 40 μL을 준비합니다. 35 μL DNA 소화 버퍼와 5 μL DNase I를 혼합합니다.
  9. 컬럼 행렬에 직접 믹스를 추가합니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
  10. 400 μL RNA 준비 버퍼를 컬럼에 넣고 원심분리기를 12,000 x g에서 30초로 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.
  11. 700 μL RNA 워시 버퍼를 컬럼에 넣고 원심분리기를 12,000 x g에서 30초로 추가합니다. 흐름을 삭제합니다.
  12. 400 μL RNA 워시 버퍼를 12,000 x g의 원심분리기와 원심분리기를 2분 간 추가하여 세척 버퍼를 완전히 제거합니다. 컬럼을 RNase 가 없는 1.5mL 튜브로 조심스럽게 전송합니다.
  13. 컬럼 매트릭스에 15 μL 뉴클레아제 없는 물을 직접 넣습니다. 1분 동안 12,000 x g에서 5분 및 원심분리기를 배양합니다.
    참고: 용출된 RNA를 수집하고 컬럼에 다시 적용하여 수율을 높입니다. 1분 동안 12,000 x g의 원심분리기.
  14. 샘플을 얼음 위에 놓고 나노 드롭에 샘플을 정량화합니다.
  15. 샘플을 -80°C에 저장합니다.

8. RT-PCR 분석

참고 : 이 단계에서, 우리는 dystrophin mRNA의 발현을 검출하기 위해 시약의 제안을 제시하지만, 쉽게 선택의 다른 시약에 적응 할 수있다.

  1. 역전사
    1. 모든 시약을 해동하고 얼음위에 보관하십시오.
    2. 5x 반응 버퍼 4μL, dNTP 믹스 2μL(10mM), 리보록 RNase 억제제 1μL, RevertAid RT 1μL로 혼합을 준비합니다.
    3. 튜브와 원심분리기를 간단히 섞습니다.
    4. 0.2 mL PCR 튜브에서 반응당 1 μg를 갖기 위해 적절한 RNA 부피를 추가합니다. 뉴클레아제없는 물 q.s.p 12 μL을 추가하십시오. RNA 대신 뉴클레아제가 없는 물을 가진 네거티브 컨트롤과 하나의 튜브로서 역전사가 없는 튜브를 포함한다.
    5. 튜브 당 반응 믹스8 μL을 분배합니다. 총 부피는 20 μL입니다.
    6. 튜브를 열순환기에 놓고 25°C에서 5분 동안 배양한 다음 42°C에서 60분 동안 배양합니다. 70°C에서 5분간 가열하여 반응을 중지합니다.
    7. 튜브를 얼음이나 -20°C에 배치하여 더 오래 보관하십시오.
  2. PCR
    참고: 바람직하게는 엑슨 접합부에서 프라이머를 디자인하는 것이 좋습니다.
    1. 소용돌이 시약및 사용하기 전에 아래로 회전.
    2. 0.5 μL 포워드 프라이머(25 μM), 0.5 μL 역프라이머(25 μM), 12.5 μL 2x PCR 마스터 믹스, 시료당 8.5 μL의 누름을 사용하여 마스터 믹스를 준비한다.
    3. 각 샘플에 대한 튜브에 마스터 믹스의 알리 쿼트 22 μL.
    4. 각 PCR 튜브에 3 μL의 cDNA(150 ng)를 추가합니다. PCR 음성 제어 튜브에 뉴클레아제없는 물 3 μL을 추가합니다.
    5. 소용돌이와 PCR 튜브아래로 회전.
    6. 3분 동안 95°C, 30초동안 95°C, (Tm-5) °C에서 30초, 72°C(1분/kb) 34회, 72°C에서 5분 동안 72°C의 튜브를 배양한다.
      참고: 최적의 어닐링 온도는 경험적으로 결정될 수 있습니다. 제안된 마스터 믹스의 경우 프라이머 용융 온도에서 5°C를 뺍니다.
    7. 아가로즈 젤에 PCR 반응의 12 μL을 로드하고 -20 °C에서 샘플을 동결.

9. 웨스턴 블로팅에 의한 영양실래 발현 검출

참고: 이 프로토콜은 대형 막 단백질인 디스트로핀에 최적화되어 있습니다. 특정 조건은 다른 단백질을 위해 필요할 지도 모릅니다.

  1. 단백질 추출
    1. 7-21일 분화 후, 100 μL 0.5M EDTA 및 50 μL 프로테아제 억제제가 있는 PBS 5mL로 세포를 수집합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 1,200 x g에서 원심분리기. 스냅 액체 질소에 튜브를 찍어 펠릿을 동결. 펠릿을 -80°C에 저장하거나 용해 단계로 진행한다.
    2. 디지토닌의 1%, 프로테아제 억제제 1%, 인산 억제제 10%, 염기 버퍼(셀 펠릿당 60μL)를 추가하여 용해 버퍼를 준비한다.
    3. 얼음 위에 셀 펠릿에 60 μL의 리시스 버퍼를 넣습니다. 5 초 동안 초음파 처리합니다. 8 초 동안 얼음에 앉아 보자. 초음파 처리 및 휴식 단계를 두 번 반복합니다.
    4. 30 분 동안 얼음에 샘플을 배양.
    5. 원심분리기는 4°C에서 20분 동안 14,000 x g에서 원심분리기.
    6. 깨끗한 튜브에 상체를 전송합니다.
    7. 제조 업체 지침에 따라 bicinchoninic acid (BCA) 분석에 의해 샘플을 정량화.
    8. 단백질 용액을 적절한 볼륨의 Laemmli 버퍼와 혼합합니다. 100 μg의 알리쿼트를 만듭니다. 필요한 경우 기본 리시스 버퍼로 부피를 25 μl로 조정합니다. 샘플을 -80°C에 저장합니다.
  2. 웨스턴 블로팅
    1. 얼음에 샘플을 해동.
    2. 샘플을 100°C에서 5분간 분해한 다음 얼음으로 식히고 회전합니다.
    3. 200mLdH2O로 20X 트리아세테이트 SDS 러닝 버퍼를 희석하고 500 μL 항산화제를 추가합니다.
    4. 빗을 제거하고 dH2O. 전기 포근 기 장치에서 젤을 조립하여 3-8 % 트리아세테이트 폴리 아킬라미드 젤을 준비합니다. 내부 챔버를 실행 버퍼로 채웁니다.
    5. 단백질 사다리 5 μL과 젤에 25 μL의 시료를 적재합니다. 실행 중인 버퍼로 외부 챔버를 채웁니다.
    6. 4 °C에서 1 시간 동안 80 V에서 실행하십시오. 이어서, 4°C에서 2h에 대해 120 V로 한다.
    7. 20X 메탄올 150mL, 20X 이송 버퍼 150mL, dH2O의2,700mL로 1X 이송 버퍼 3L을 4°C로 냉각시한다.
    8. 필터 용지 4장과 니트로셀룰로오스 멤브레인 1장을 잘라냅니다. 전달 버퍼가 있는 트레이에 용지 필터와 멤브레인을 담그십시오.
    9. 케이스에서 젤을 부드럽게 제거하고 필터 용지, 멤브레인 및 스폰지로 전달 장치에 조립합니다. 젤은 양수 측에 음의 측면과 멤브레인에 배치됩니다.
    10. 300 mA에서 전송을 실행, 교반, 4 °C에서, 하룻밤.
    11. 실온에서 부드러운 교반으로 1h의 블로킹 버퍼를 10mL로 막습니다.
    12. 블로킹 버퍼 10mL 및 디스트로핀 항체 50 μL(1:200)으로 1차 항체 용액을 준비한다.
    13. 차단 버퍼를 폐기하고 1차 항체 용액을 추가합니다. 실온에서 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 적어도 2 시간 동안 부드러운 동요로 배양하십시오.
    14. 0.1% Tween PBS로 멤브레인을 3번 헹구고 5분 동안 부드러운 동요로 헹구습니다.
    15. 블로킹 용액 10mL, 항래비항체 2μL(1:5000), 0.2% 트위엔 20μL를 사용하여 이차 항체 용액을 준비한다.
    16. 이차 항체 용액을 멤브레인에 추가합니다. 가벼운 것을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮인 부드러운 교반으로 1h에 큐베이션하십시오.
    17. 항체 용액을 버리고 0.1 % Tween PBS로 멤브레인을 3 번 헹구고 부드러운 동요로 5 분 동안 빛으로부터 보호합니다.
    18. 이미징 장치에서 멤브레인을 노출하고 이미지합니다.
    19. 제조업체 지침에 따라 700 총 단백질 얼룩으로 총 단백질을 위한 막얼룩.
      참고: 서양 얼룩에 의한 Dystrophin 검출은 환자의 나이/돌연변이와 충분한 dystrophin을 축적하기에 충분한 시간을 융합하고 유지하는 세포의 능력에 달려 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜은 인간의 피부 유래 섬유아세포 배양을 확립하고 근막세포로 변환한 다음 차별화된 근문으로 변환하는 방법을 보여줍니다. 세포주의이 유형은 신경 근육 장애의 연구 와 잠재적인 치료의 체외 테스트에 매우 유용합니다.

섬유아세포 변환의 회로도 표현은 도 1에도시된다. 도 2A는 피부의 파편과 섬유아세포가 그것에서 나오는 것을 보여줍니다. 섬유아세포는 합류에 도달하면 새로운 접시에 전달되어야한다(그림 2B). 도 3A는 독시사이클린으로 보충된 근아세포 성장 매체로 변경하기 전에 섬유아세포의 이상적인 합류를 나타낸다. 세포는 변환 과정에서 여전히 증식하기 때문에 약 70 % 컨실수있어야합니다. 세포가 80% 이상인 경우 분화가 손상될 수 있습니다. 근세...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

좋은 품질의 FM 셀라인을 얻으려면 몇 가지 단계가 중요합니다. 피부 생검이 빨리 처리될수록 건강한 섬유아세포를 얻을 확률이 높아집니다. 섬유아세포 배양의 통과 수도 중요하다. 1 차 세포는 증식 능력이 제한되어 있으며 많은 구절 후에 복제 노화로 들어갑니다. 따라서, 낮은 통로 수에 섬유아세포의 재고를 가지고 가능한 한 초기 통로에서 세포를 변환하는 것이 좋습니다.

또 다른 중요한 단계는 또한 최대 순도와 정확한 정량화가 있는 바이러스 성 생산을 하는 것입니다. 예를 들어, qPCR을 이용한 바이러스 게놈 정량화는 합리적인 측정을 제공하지만 ddPCR(디지털 물방울 PCR)에 의한 정량화가 더 정확합니다.

또한, myoblast 변환을 위한 섬유아세포의 적당한 합류는 중요합니다. 세포가 70% 이하인 경우 80% 이상이 수렴되면 근생 분화가 손상될 수 있습니다. 세포가 너무 혼잡한 경우에, 염색과 화상 진찰을 방해하는 근사의 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

전국 어린이 병원은 Audentes 치료에 여기에 설명 된 엑슨 2 건너 뛰기 프로그램을 허가했다. K.M.F.와 N.W.는 이 라이센스의 결과로 로열티 지급을 받았습니다.

감사의 글

우리는 모델에 대한 과거에 자신의 지식을 공유 빈센트 Mouly 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립 보건국국립신경장애및뇌졸중연구소(R01 NS043264(K01 NS043264,K.M.F.에 의해 지원되고 있다. 및 R.B.W.)), 미국 국립 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M.M, R.N.및 N.W.). N.W.는 오하이오 주립 대학 / 전국 아동 병원 근육 그룹과 필립 재단으로부터 펠로우십 지원을 받았습니다. 이 작품은 또한 내부 임의 기금에 의해 지원되었으며, exon 2 건너 뛰기 작업의 일부는 CureDuchenne (K.M.F.) 및 협회 Francaise Contre 레 Myopathies에 의해 지원되었습니다. IRB 번호: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 및 IBCSC#: IBS00000123.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mm 접시Corning430167
0.25% Trypsin-EDTA, 페놀 레드Thermo Fisher2500056
10X 인산염 완충 식염수(PBS)Fisher ScientificBP3994
12웰 플레이트Corning3513
20X 전달 버퍼Thermo FisherNP00061
20X Tris-acetate SDS 러닝 버퍼Thermo FisherLA0041
3-8% Tris-Acetate gelThermo FisherEA0378BOX
75 cm2 flaskCorning430641U
Antibiotic-Antimicotic 100XThermo Fisher15240062
Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibodyDevelopmental Studies Hybridome BankMF20 superlabantDilution 1:50
항산화Thermo FisherNP0005
BCA 단백질 분석Thermo Fisher23227
클로로포름시그마-알드리치C2432
DAPI써모 피셔D3571희석 1:1000
디지토닌밀리포어 시그마300410250MG
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치D2438
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산써모 피셔10569044
DNAse I 세트 (250U)자이모 리서치 코퍼레이션E1010
독시사이클린 하이드로클로라이드 피셔 사이언티픽BP2653-5
Dup2 인간 프라이머Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'
디스트로핀 항체Abcamab15277희석 1:200
소 태아 혈청Thermo Fisher16000
글리신Sigma-AldrichG8898
염소 안티 마우스, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001희석 1:1000
중단 프로테아제 억제제 칵테일 100XThermo Fisher78430
혈구계Hausser Scientific3100
Hygromycin BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD 염소 안티 토끼 IgG (H+L)Li-Cor926-68071희석 1:5000
Lab-Tek II CC2 챔버 슬라이드 시스템Thermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamine 3000 Transfection 시약Thermo FisherL3000008
Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스Corning354230
메탄올Fisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty 냉동 용기Thermo Fisher51000001
니트로셀룰로오스 멤브레인 0.45 µ mGE Healthcare Life Sciences10600002
Normal Goat Serum ControlThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003웨스턴 블롯
Opti-MEM I 저감 혈청 MediumThermo Fisher11058021
파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127
PCR 마스터 믹스Thermo FisherK0172
포스파타제 억제제Thermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Western Blot NormalizationLi-Cor926-11021
RevertAid 키트써모 피셔K1691
RNA 클린 & Concentrator-25Zymo Research CorporationR1018
메스아스펜 외과 372611
골격근 세포 분화 매체PromocellC23061
골격근 세포 성장 매체PromocellC23060
Triton X-100Acros 유기물215682500
TRIzol 시약Thermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
초저온 냉동고Thermo Scientific7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Vectashield 퇴색 방지 마운팅 매체Vector LabsH1000

참고문헌

  1. Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
  2. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
  3. Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
  4. Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).
  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
  6. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  7. Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
  8. Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).
  9. Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
  10. De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
  11. Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
  12. Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
  13. Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
  14. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

섬유아세포 재프로그래밍근아세포 분화렌티바이러스 형질도입hTERT 불멸화MYOD 유도독시사이클린 처리근관 형성피부 생검
신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.