여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.
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이 논문에서
요약
초록
pre-mRNA 접합은 복잡한 성분의 조립, RNA 처리 및 방출 중에 화려한 하위 복합체의 많은 분자 재배열을 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 글리세롤 그라데이션 원심분리는 기능적 및 구조적 연구를 위해 단백질 또는 RNP(RiboNucleoProtein) 복합체의 분리를 위해 사용되어 왔다. 여기서는 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법을 위한 거대 분자 복합체를 정화하고 안정화하기 위해 처음 개발된 Grafix(그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하며, 이는 스플렉션 컴플렉스에 일시적으로 결합되는 접합 인자 간의 상호 작용을 식별합니다. 이 방법은 시료의 원심분리를 복합체안정화를 위한 고정 시약의 농도증가로 기초한다. 글리세롤 그라데이션에 적재된 효모 총 추출물의 원심분리 후, 회수된 분획은 점블롯에 의해 분석되어 개별 접합 인자의 존재의 현물 및 의결을 위해.
서론
접합은 조정된 방식으로 다양한 요인의 바인딩 및 방출이 필요한 매우 역동적인 프로세스입니다. 이러한 접합 요인은 RNA 결합 단백질, ATPases, 헬리케이스, 단백질 키나아제 및 인산염, 유비퀴틴 리개세, 그 외1,2,3을포함한다. 그리고 분자 재배열이 일어날 수 있도록, 이러한 요인 중 일부는 매우 일시적인 이 RNP 중간 복합체의 격리 및 식별을 매우 어렵게 만듭니다.
여기서, 그라픽스 법4,5는 B액트 복합체 6과 효모 접합인자 Cwc24의 상호작용을 안정화하고, 유비퀴틴 리구아제 Prp19가 19(NTC)의 결합 또는 방출에 어떤 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해B액트 복합체6을 사용하였다. 장소. 글리세롤 그라데이션을 따라 크로스링커의 농도가 증가하는 거시분자를 노출시키는 장점은 복합간 교차링크4,5,
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프로토콜
1. 효모 총 추출물 준비
- TAP태그9에 융합된 접합인자 중 하나를 발현하는 효모 세포를 성장시키는 데 적합한 아미노산 또는 핵염기와 함께 L YNB-glu 미디어(효모 질소 기준 2%m/v 포도당으로 보충됨), 이 경우 아데닌(20 μg/mL), 류신(30 μg/mL), 트립토판(30 μg/mL), OD600 = 1.0까지.
- 1L 배양으로부터 100mL 원심분리기 병 3개에서 17,000x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 10mL 의 차가운 멸균물로 두 번 세척한다.
- 수집된 효모 세포를 콜드 버퍼 A의 세포 부피 1/10에서 재연하여(10mmolL-1 HEPES pH = 7.9, 1.5mmol L-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl, 5% v/v 글리세롤, 0.5mmolL-1 DTT, EDTA-프리 프로제스트 억제제).
- 액체 질소에 셀 현탁액의 작은 방울을 동결. 작은 방울은 재중단 된 세포 용액을 파이프팅하고 50 μL을 액체 질소에 직접 떨어뜨려 얻을 수 있습니다.
주의: 액체 질소는 피부 또는 눈과 접촉하....
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결과
Cwc24-TAP의 퇴적 프로파일을 분석하고 Grafix 방법이 서브콤플렉스를 접합하는 데 결합을 안정화시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 우리는 글리세롤 그라데이션에 원심분리를 통해 Cwc24-TAP를 표현하는 세포의 총 효모 추출물을 분리하여 교차 연결제로 글루타랄데히드의 존재 또는 부재에 있다. 24μL 분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 슬롯 블롯에 의해 분석되었다. 결과는 크로스링커가 없는 경우 Cwc24가 분획 5와 13(도1B)사이에 집중되어 있으며, 약 80~200MDa14의복합체에 해당한다. 그러나, 크로스링커의 존재에서, 그라데이션에 Cwc24의 위치는 더 큰 복합체에 대응하는 그라데이션의 하단에 분수로 이동된다(도1). 이러한 결과는 글루타랄데히드가 접합 복합체와 Cwc24의 협회를 안정화한다는 것을 나타냅니다.
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토론
단백질 단백질 및 리보핵산 단백질 상호 작용은 교차 연결제를 사용하여 안정화될 수 있다. 결과 복합체는 글리세롤 그라데이션에 대한 초원심분리를 견딜 수 있는 안정성이 있는 것이 중요합니다. 또한 버퍼 조건은 상호 작용을 허용해야하지만 비특정 바인딩을 피할 수 있을 만큼 엄격해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서, 우리는 이미 시험관 내 접합 반응(15)에대해 확립 된 버퍼 솔루션을 사용했다.
원심분리의 속도와 시간은 분석되는 복합체에 최적화되어야 합니다. 우리는 다른 퇴적 조건, 원심 분리 샘플 94,000 x g및 194,000 x g에서 4 °C에서 16 시간 동안, 유사한 결과를 테스트했습니다. 이러한 컨트롤은 분석중인 복합체가 침전되지 않는 조건을 결정하는 데 중요합니다.
우리는 또한 다른 블롯 방법을 테스트, 멤브레인에 직접 파이펫, 슬롯 블롯 또는.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 FAPESP 보조금 (15/06477-9)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG GE | Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | EconoSystem의 일부 : 연동 펌프, UV 검출기 및 분획 수집기 |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| 분획 회수 시스템 | Beckman Coulter | 270-331580 | |
| 107-201M | |||
| 믹서 밀 MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill 장치 |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | 의 부품에 연결된 튜브 천공 장치Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| 스윙 버킷 로터 P40ST | Hitachi | ||
| 초원심분리기 CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear 원심분리기 튜브(14 x 89mm) | Beckman Coulter | 344059 |
참고문헌
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y.
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재인쇄 및 허가
