사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

요약

여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.

초록

pre-mRNA 접합은 복잡한 성분의 조립, RNA 처리 및 방출 중에 화려한 하위 복합체의 많은 분자 재배열을 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 글리세롤 그라데이션 원심분리는 기능적 및 구조적 연구를 위해 단백질 또는 RNP(RiboNucleoProtein) 복합체의 분리를 위해 사용되어 왔다. 여기서는 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법을 위한 거대 분자 복합체를 정화하고 안정화하기 위해 처음 개발된 Grafix(그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하며, 이는 스플렉션 컴플렉스에 일시적으로 결합되는 접합 인자 간의 상호 작용을 식별합니다. 이 방법은 시료의 원심분리를 복합체안정화를 위한 고정 시약의 농도증가로 기초한다. 글리세롤 그라데이션에 적재된 효모 총 추출물의 원심분리 후, 회수된 분획은 점블롯에 의해 분석되어 개별 접합 인자의 존재의 현물 및 의결을 위해.

서론

접합은 조정된 방식으로 다양한 요인의 바인딩 및 방출이 필요한 매우 역동적인 프로세스입니다. 이러한 접합 요인은 RNA 결합 단백질, ATPases, 헬리케이스, 단백질 키나아제 및 인산염, 유비퀴틴 리개세, 그 외^1,2,3을포함한다. 그리고 분자 재배열이 일어날 수 있도록, 이러한 요인 중 일부는 매우 일시적인 이 RNP 중간 복합체의 격리 및 식별을 매우 어렵게 만듭니다.

여기서, 그라픽스 법^4,5는 B액트 복합체 6과 효모 접합인자 Cwc24의 상호작용을 안정화하고, 유비퀴틴 리구아제 Prp19가 19(NTC)의 결합 또는 방출에 어떤 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해^B액트 복합체^6을 사용하였다. 장소. 글리세롤 그라데이션을 따라 크로스링커의 농도가 증가하는 거시분자를 노출시키는 장점은 복합간 교차링크^4,5,따라서 골재형성을 피한다는 것이다.

이 방법은 단백질 면역 침전 및 풀다운 분석에 대한 보완으로 사용되었으며, 이는 큰 복합체의 분리를 허용함에도 불구하고 큰 동적복합체^7,8내에서 과도 상호 작용을 유지하는 데 신뢰할 수 없을 수 있다. 글리세롤 그라데이션에서 고정 시약을 사용하면 이러한 요인의 결합을 안정화시켜 접합 서브콤플렉스와 특정 단백질의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 선택된 크로스링커는 화학적으로 돌이킬 수 없기 때문에, 회수된 분획에 존재하는 단백질은 그라데이션 원심분리 후 점블롯에 의해 분석되었다.

프로토콜

1. 효모 총 추출물 준비

1. TAP^태그9에 융합된 접합인자 중 하나를 발현하는 효모 세포를 성장시키는 데 적합한 아미노산 또는 핵염기와 함께 L YNB-glu 미디어(효모 질소 기준 2%m/v 포도당으로 보충됨), 이 경우 아데닌(20 μg/mL), 류신(30 μg/mL), 트립토판(30 μg/mL), OD₆₀₀ = 1.0까지.
2. 1L 배양으로부터 100mL 원심분리기 병 3개에서 17,000x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 10mL 의 차가운 멸균물로 두 번 세척한다.
3. 수집된 효모 세포를 콜드 버퍼 A의 세포 부피 1/10에서 재연하여(10mmol^L-1 HEPES pH = 7.9, 1.5mmol L^-1 MgCl_2,50mmol^L-1 KCl, 5% v/v 글리세롤, 0.5mmol^L-1 DTT, EDTA-프리 프로제스트 억제제).
4. 액체 질소에 셀 현탁액의 작은 방울을 동결. 작은 방울은 재중단 된 세포 용액을 파이프팅하고 50 μL을 액체 질소에 직접 떨어뜨려 얻을 수 있습니다.
   주의: 액체 질소는 피부 또는 눈과 접촉하여 부상을 입을 수 있습니다. 적절한 안전 장비를 사용하여 처리하십시오.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 셀 서스펜션의 냉동 방울은 -80 °C에 저장 될 수있다.
5. 20Hz/s에서 6사이클을 통해 볼밀 장치에서 3분 동안 효모 세포용광을 준비합니다.
   참고: 각 주기 후에, 녹지 않도록 액체 질소에 얼어붙은 세포를 품고 있는 용기를 담그세요. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 냉동 추출물은 -80°C에 보관할 수 있습니다. 효모 접합 추출물은 균질화제를 사용하여 구엽세포^10을용해하거나 박격포 및^{유봉(11,12)을}사용하여 제조할 수 있다.
6. 실내 온도에서 물에 들어 있는 튜브를 물에 넣고 가끔 흔들어 서 추출물을 녹입니다.
7. 원심분리기는 4°C에서 1h에 45,000 x g에서 추출합니다.
8. BCA^{방법(13)에}의해 지워진 상체의 단백질 함량을 정량화한다.
9. 추출물의 알리쿼트를 준비하고 액체 질소에 빠르게 고정하고 -80 °C에 보관하십시오.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

2. 글리세롤 그라데이션 준비

1. 버퍼 A에 두 개의 글리세롤 솔루션을 준비, 하나는 포함 10% v/v 와 다른 포함 30% v/v 글리세롤.
2. 30% v/v 글리세롤 용액에 교차 연결 제글루타랄데히드를 0.1% v/v에 넣고 혼합하여 균질화합니다.
   주의: 적절한 안전 장비를 사용하여 연기 후드 내부의 글루타랄데히드를 처리하십시오.
3. 12mL 원심분리기 튜브(14 x 89mm) 하단에 차가운 10% v/v 글리세롤 용액 6mL를 추가합니다.
4. 튜브 하단에 그라데이션 마스터 장치가 제공된 긴 바늘에 부착된 주사기로 글루타랄데히드로 보충된 감기 30% v/v 글리세롤 용액6mL을 10% v/v 글리세롤 용액 아래에 추가합니다.
   참고: 또는, 10% v/v 글리세롤 용액은 30% v/v 글리세롤/글루타랄데히드 용액의 상단에 조심스럽게 파이프화될 수 있다.
5. 그라데이션 마스터 장치를 사용하여 연속 밀도 그라데이션을 생성합니다.
   참고: 그라데이션 마스터 장치에서 튜브는 매개 변수(시간/각도/속도)를 결정하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 적절한 랙에 배치되고 잠시 회전됩니다. 이 작품에서 우리는 사용 : 2:25 분 / 81.5 ° / 11 rpm.
6. 셀 추출물을 첨가하기 직전에 7% v/v 글리세롤/버퍼 A 쿠션의 200 μL을 조심스럽게 상단에 넣습니다.
   참고: 쿠션의 글리세롤 농도는 선형 그라데이션을 만드는 데 사용되는 농축 글리세롤 용액보다 낮어야 합니다.

3. 원심분리추출

1. 쿠션으로 12mL 선형 글리세롤 그라데이션 10%-30% 글루타랄데히드의 상단에 총 단백질 약 2 mg을 적재합니다.
2. 미리 냉각된 스윙 버킷 로터에 튜브를 놓습니다.
   참고: 초원심분리 전에 혼합하지 않도록 튜브를 부드럽게 처리합니다.
3. 원심분리기는 4°C에서 16h의 194,000 x g에서 원심분리기.
4. Aliquot각 12 mL 튜브24 500 μL 분획적응 된 EconoSystem을 사용 하거나 신중 하 게 파이펫팅에 의해 분수.
   참고: 적응된 EconoSystem은 연동 펌프, UV 검출기 및 튜브 천포링 장치에 연결된 분수 수집기로 구성됩니다. 침전 프로파일은 280 nm에서 흡광도의 측정에 의해 모니터링될 수 있다.
5. 연동 펌프를 통해 40% v/v 글리세롤 용액을 사용하여 튜브에서 분획 수집기로 글리세롤10%-30%의 그라데이션을 밀어넣습니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 사용 전까지 분획을 -80°C에 보관합니다.
6. 점 얼룩 또는 슬롯 블롯 장치에 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 직접 각 분획의 50 μL을 로드합니다. CBP에 대한 항체를 이용한 면역블롯(1:6,000, TAP 태그의 CBP 부분을 검출함) 및 호스레디시어 페록시다제(1:15,000)와 결합한 항래빗 IgG를 이차 항체로 검출한다.

결과

Cwc24-TAP의 퇴적 프로파일을 분석하고 Grafix 방법이 서브콤플렉스를 접합하는 데 결합을 안정화시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 우리는 글리세롤 그라데이션에 원심분리를 통해 Cwc24-TAP를 표현하는 세포의 총 효모 추출물을 분리하여 교차 연결제로 글루타랄데히드의 존재 또는 부재에 있다. 24μL 분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 슬롯 블롯에 의해 분석되었다. 결과는 크로스링커가 없는 경우 Cwc24가 분획 5와 13(도1B)사이에 집중되어 있으며, 약 80~200MDa^14의복합체에 해당한다. 그러나, 크로스링커의 존재에서, 그라데이션에 Cwc24의 위치는 더 큰 복합체에 대응하는 그라데이션의 하단에 분수로 이동된다(도1). 이러한 결과는 글루타랄데히드가 접합 복합체와 Cwc24의 협회를 안정화한다는 것을 나타냅니다.

토론

단백질 단백질 및 리보핵산 단백질 상호 작용은 교차 연결제를 사용하여 안정화될 수 있다. 결과 복합체는 글리세롤 그라데이션에 대한 초원심분리를 견딜 수 있는 안정성이 있는 것이 중요합니다. 또한 버퍼 조건은 상호 작용을 허용해야하지만 비특정 바인딩을 피할 수 있을 만큼 엄격해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서, 우리는 이미 시험관 내 접합 반응^(15)에대해 확립 된 버퍼 솔루션을 사용했다.

원심분리의 속도와 시간은 분석되는 복합체에 최적화되어야 합니다. 우리는 다른 퇴적 조건, 원심 분리 샘플 94,000 x g및 194,000 x g에서 4 °C에서 16 시간 동안, 유사한 결과를 테스트했습니다. 이러한 컨트롤은 분석중인 복합체가 침전되지 않는 조건을 결정하는 데 중요합니다.

우리는 또한 다른 블롯 방법을 테스트, 멤브레인에 직접 파이펫, 슬롯 블롯 또는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG GE	Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	EconoSystem의 일부 : 연동 펌프, UV 검출기 및 분획 수집기
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
분획 회수 시스템	Beckman Coulter	270-331580
	107-201M
믹서 밀 MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill 장치
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	의 부품에 연결된 튜브 천공 장치Thermo Scientific	36-101-0816
스윙 버킷 로터 P40ST	Hitachi
초원심분리기 CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear 원심분리기 튜브(14 x 89mm)	Beckman Coulter	344059