MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

대사 산물, 뉴클레오티드, 아미노산 또는 유기산, 지질을 포함한 신진 대사의 중간 또는 최종 제품은 생물학적 기능 및 프로세스의 핵심 구성 요소입니다. 대사 산물의 연구 인 Metabolomics는 생화학적 상호 작용의 탐구와 기본, 번역 및 임상 연구의 맥락에서 자신의 역할에 대한 이해를 허용합니다. 대사 산물은 유기체의 표현형과 강하게 연관되고 세포 대사¹중에 발생하는 생화학적 활동에 대한 정보를 제공한다. 따라서 유전체학 및 프로테오믹스 외에도 메타볼로믹스는 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 도구로 부상했습니다. 예를 들어, 메타볼로믹스는 기존 약물의 메커니즘과 관용을 해명하는 데 사용됩니다. 약물 개발에서, xenobiotic 물질 대사는 나중에 개인화 된 약을 지원하는 것으로 변환 종에 걸쳐 대사 산물의 활성 또는 독성을 평가하는 데 유용합니다^2. 메타볼로믹스의 광범위한 적용에도 불구하고 대사산물의 이미징은 대사산물의 화학 반응성, 구조적 이질성 및 광범위한 농도 범위^3으로인해 어려울 수 있다. 그러나, 고에너지 화합물, 포도당, 젖산, 글리코리틱, 펜토스 션트 경로 및 TCA 주기 중간체, 인지질, 신경전달물질, 신호화합물 등 음비대사산물의 농도는 조직 수확 절차 중에 조직 효소가 활성화될 때 몇 초 안에 변화하고 진행될 수 있으며, 포스트모템은 뇌 수확^시술(4) 뇌수확에 6, 뇌 수확술 등 뇌수확시 6, 뇌 수확술 등^4,뇌수확에 신경이 쓰이는 등 뇌의 약자 수수(⁴⁾ . 정확한 메타볼로믹스 데이터 수집을 보장하기 위해 적절하고 신중한 샘플 준비는^7,8매우중요합니다. 대사 산물을 측정하기위한 현재 확립 된 플랫폼은 NMR, 효소 분석 및 질량 분석법 (액체 및 가스 크로마토그래피 포함)을 포함하며, 그 중 마지막은 아래에서 더 논의됩니다.

MALDI-MSI는 개별 분자 종의 검출을 통해 복잡한 견본의 분석을 허용하는 최첨단 기술입니다. MALDI MSI는 생물학적 샘플에서 다양한 분자 화합물을 신속하고 재현적으로 측정할 수 있다는 이점을 부여합니다. 질량 분석 이미징은 복합 대사 산물에 기초하여 조직 생물학을 나타내는 이미지의 생산을 더욱 허용하고, 샘플^9에서대사 산물의 공간 분포를 보존하면서 그렇게한다. MALDI의 항체 라벨링, 구조적 변형 또는 면역스테인링에 사용되는 것과 같은 기타 특수 시약을 사용하지 않고 샘플에서 분석체를 검출하는 MALDI의 능력은 단일 실험 내에서 수백 개의 분자를 모니터링하는 능력과 결합되어 대사^{프로파일링(10)에}관해서 MS 이미징이 부여하는 몇 가지 장점만을^{포함합니다. 11}. 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 9-아미노아크리딘(9-AA)과 같은 일반적으로 사용되는 매트릭스 외에도 최근에 발견된 새로운 매트릭스 N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로리드(NEDC)는 다양한 저분자 중량 대사산물의 분석에 적합하며, MALDI^12의MALDI 적용을 더욱 개선하였다.

MALDI MSI의 광범위한 적용에도 불구하고, 계측기의 높은 비용과 실험 절차의 복잡성은 개별 연구 실험실에서 의 광범위한 구현을 방지합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 통해 지원됩니다. 슬라이드 제제 및 매트릭스 코팅을 포함한 샘플 제제는 MALDI MSI에서 가장 중요한 단계입니다. 그러나, 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구원의 실험실에서 수행됩니다, 이는 나중에 MALDI MSI 취득에 있는 잠재적인 변이를 만듭니다. 여기서 는 MALDI MSI 측정을 진행하기 전에 생물학적 샘플의 샘플 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 발달 마우스 뇌의 메타볼로믹 프로파일링을 예로 사용하는 것을 목표로 합니다.

이 프로토콜은 뉴욕 시 대학 (CUNY) 고급 과학 연구 센터 (ASRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침을 따릅니다.

1. 조직을 수확

1. 알루미늄 보트를 준비합니다. 사각형 알루미늄 10cm x 20cm를 준비하고 중간에 접어 10cm 이중 층 사각형을 만듭니다. 샘플 정보를 한쪽에 표시하고 다른 쪽을 접어 서 바닥 표면이 약 4cm x 4cm인 보트를 형성합니다.
2. 스티로폼 상자에 액체 질소(LN_2)를미리 식힙니다.
   참고: 보트가 너무 작으면 샘플이 보트에서 떨어지고 LN_2에직접 연락하여 냉동되어 냉동이 될 수 있으며, 이는 냉동 절제 중에 파편화될 수 있습니다.
3. 기관 IACUC 지침에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 안락사, 즉시 관심의 조직을 해부.
   1. 동물 마취와 스냅 동결 사이의 간격을 가능한 한 짧게 유지, 조직 수확 하는 동안 대사 산물의 변경을 최소화 하기 위해, 특히 사후 허혈으로 인해 뇌의 labial 대사 산물.
      참고: 인산염 완충식식염(PBS)을 가진 동물을 관류하면 허혈의 지속 시간이 증가하여 음순 대사 산물의 농도를 더욱 변화시키고 관절 결과를 과장합니다. 따라서, 혈액또는 체액의 오염이 대사산물보다 더 신경이 쓰지 않는 한, PBS로 조직을 세척하거나 세척하는 것은 권장되지 않는다.
4. 즉시 액체 질소에 떠있는 알루미늄 보트에 조직을 놓고 스티로폼 상자의 뚜껑을 닫고 조직의 크기에 따라 2-10 분 동안 동결하십시오 : 산후 날 1 (P1), P21, P60 마우스 뇌, P60 쥐 뇌는 각각 2 분, 5 분, 7 분, P60 쥐 뇌에 대해 각각 10 분.
   참고: 과다 냉동이 극저온 절제 중에 조직 단편화로 이어질 수 있기 때문에 장기간(예: P1 마우스 뇌의 경우 5분)동안 조직을 동결하지 마십시오.
5. 포셉에 의해 보트를 제거하고, 호일을 접어 조직을 감싸고, 드라이 아이스를 운반하고 나중에 사용하기 위해 -80 °C에 저장하십시오. 즉각적인 단면이 뒤따르는 경우, 드라이 아이스의 샘플을 냉동고스트로 운반하십시오.
   참고: 대사 산물을 더 잘 보존하기 위해, MALDI 이미징을 진행하기 직전에 샘플을 그대로 조직에 저장하고 절개하는 것이 바람직하다. 조직은 최대 24개월 동안 -80°C로 저장할 수 있다.

2. 조직을 극저온

참고: Indium 티산화(ITO) 슬라이드를 처리할 때 항상 장갑을 착용하십시오. 슬라이드에 직접 호흡을 하지 마십시오 또는 티슈 섹션에 인간의 타액의 오염을 방지하기 위해 마스크 (선택 사항)를 착용하지 마십시오.

1. 조직을 단면화하기 전에 원하는 수의 MALDI 호환 ITO 코팅 유리 슬라이드를 수집합니다.
2. 저항에 설정된 볼트계를 사용하여 슬라이드의 전도도를 테스트합니다. 저항 측정이 읽히는 쪽에 레이블을 지정합니다: 이것은 조직 단면도가 준수하는 측이 될 것입니다. 오염을 피하기 위해 항상 깨끗한 종이 타월에 슬라이드를 놓습니다.
3. -20°C로 설정된 극저온에서 슬라이드를 미리 식힙니다.
4. 조직 샘플이 -80°C에서 제거된 경우, 조직의 크기에 따라 약 45-60분 동안 극저온 챔버에서 조직을 평형화하게 한다. 샘플이 드라이 아이스에서 제거되면 약 30 분 동안 보정하십시오.
5. 70% 에탄올로 저온을 철저히 청소하십시오. 저울질 챔버에서 얇은 기울어진 아티스트 브러시와 집게를 포함한 필요한 모든 도구를 미리 식힙니다.
6. 조직의 종류에 따라 저온 챔버 및 시편 헤드의 온도를 설정 : 간용 -14 °C, 근육용 -20 °C 및 피부^9에대한 -25 ° C.
7. 관심 지역에서 OCT를 피하고, 냉동 조직 포함 화합물 OCT를 사용하여 척에 조직을 마운트.
8. 깨끗한 블레이드를 무대에 놓고 잠급합니다. 원하는 절단 각도를 달성하기 위해 시편의 단계 및 각도의 위치를 조정합니다.
   참고: 조직의 다른 유형/유전자형을 절단해야 하는 경우, 블레이드의 깨끗한 부분이 사용되도록 시료를 재배치하거나 교차 오염을 방지하기 위해 다음 샘플을 절단하기 전에 새 블레이드로 변경해야 합니다.
9. 관심 영역(예: 뇌의 코퍼스 캘로섬)이 발견될 때까지 계속 절단하십시오. 극저온에 평형화 된 아티스트 브러시로 여분의 조각을 닦아 무대를 깨끗하게 유지하십시오.
10. 원하는 영역이 밝혀지면 두께10-12 μm의 작은 부분을 잘라냅니다. 단면도가 쉽게 조각하거나 떨어지는 경향이 있는 경우, -22°C에서 -11°C 범위로 유지하여 저온의 온도를 높입니다. 우리는 뇌 조직에 대한 최적의 절삭 온도가 -15 °C - 18 °C임을 발견했다.
11. 좋은 섹션이 절단되면 ITO 슬라이드에 부착하십시오 (극저온 챔버에서 작동).
12. 티슈의 한 부분을 아티스트 브러시 의 끝을 사용하여 ITO 슬라이드에 전달합니다.
13. 슬라이드 아래에 손가락을 대고 섹션을 따뜻하게 하여 섹션을 따뜻하게하여 안전한 장착을 보장합니다. 조직 섹션은 먼저 5-10 s에서 투명하게 전환한 다음 약 30-60 s에서 불투명하게 변합니다.
14. 조심스럽게 미끄럼에 슬라이드를 따로 설정합니다.
15. 조직의 각 섹션이 슬라이드에 균등하게 배치되고 가능한 한 정렬되도록 다른 조직 샘플을 위한 단계를 반복하십시오.
16. MALDI 대상은 최대 2개의 슬라이드를 보유할 수 있기 때문에 동일한 코호트의 여러 샘플의 섹션을 단일 슬라이드 또는 두 슬라이드에 배치하여 동시에 분석할 수 있도록 합니다.
17. 완료되면 ITO 슬라이드를 진공 상자에 놓고 건조제를 사용하여 건조기로 옮습니다. 45-60 분 동안 슬라이드를 진공 건조시하십시오.
    참고: 실험실에서 진공 건조기를 사용할 수 없는 경우 슬라이드를 항상 -20°C 이하로 유지하여 대사 산물 열화를 피하십시오.
18. 슬라이드 저장 및 배송: MALDI 이미징 코어 시설에서 샘플을 준비하지 않는 한 MALDI 이미징으로 직접 진행하거나- 80°C에 슬라이드를 저장하거나 건조 얼음에 대한 핵심 시설 또는 기타 MALDI 연구 실험실에 배송한다.
19. 샘플을 가장 잘 보존하려면 슬라이드를 슬라이드 수송에 넣고 질소 (선택 사항)로 채우고, 파라필름으로 밀봉하고 지퍼 백에 넣은 다음 건조제가 들어있는 다른 지퍼 백에 넣습니다. 외부 지퍼 백에 라벨을 부착하십시오.
20. -80°C(최대 6개월)에 보관하거나 적절한 드라이 아이스로 배송합니다.

3. 매트릭스 준비

1. 행렬을 준비합니다.
   참고: 모든 시약은 HPLC 등급이어야 합니다.
   1. 10 mg /mL의 농도에서 NEDC를 준비하십시오. 70% 메탄올의 용매에 용해된 10mL의 매트릭스(NEDC 100 mg, 메탄올 7mL,_H2O3mL)를 준비한다.
   2. 또한 매트릭스를 채우기 전에 분무기 시스템을 플러시하기 위해 70 % 메탄올 : 물 용액의 추가 10 mL을 준비합니다.
2. 슬라이드가 2.17 단계에서 탈수되면 굵은 점 실버 마커를 사용하여 조직 섹션 외부유리 슬라이드의 빈 공간에 "X"마크를 배치한 다음 실버 "X"위에 미세한 점 의 검은 색 마커가있는 두 번째 "x"를 놓습니다. 실버 배경(굵은 은 "X")에서 선명한 콘트라스트를 한 블랙 "X"는 나중에 MALDI 계측기의 후기 질량 스펙트럼 획득을 위한 신탁 마커역할을 합니다.
3. 슬라이드를 MALDI 슬라이드 금속 대상에 로드합니다. 플라스틱 커버를 사용하고 샘플이 플라스틱 덮개에 있는 윤곽선을 그립니다. 곁.
4. 플랫 베드 스캐너를 사용하여 MALDI 대상과 함께 슬라이드 이미지를 스캔합니다. 대상 표면의 나사는 스캐너에 의한 조직 섹션의 손상 또는 오염을 방지하기 위해 스페이서 역할을 합니다. 선택한 슬라이드 영역을 16비트 그레이스케일 및 2400 dpi로 미리 보고 스캔합니다. MALDI MSI에서 나중에 사용할 이미지를 저장합니다.

4. 매트릭스 증착

참고: 승화, 액적 잉크젯 인쇄, 자동 매트릭스 분무기 및 아티스트 에어부시^9를사용하여 수동 스프레이를 포함하여 MALDI 슬라이드에 미세 한 결정 크기의 매트릭스의 짝수 층을 적용하는 여러 가지 방법이 있습니다. 우리는 높은 재현성을 위해이 프로토콜의 예로 자동 매트릭스 분무기를 사용합니다.

1. 시작: 매트릭스 분무기 장치를 켜고 밸브가 LOAD에 배치되어 있는지 확인하고 분무기 소프트웨어를 시작합니다. 배기 팬이 잘 작동하고 있는지 확인합니다. 액티브 통풍구가 제대로 작동하지 않는 경우 용매 펌프를 시작하지 마십시오.
2. 모든 것이 통신하고 있음을 Comms 탭에서 확인한 다음 ~500 psi (또는 3.4 MPa)의 역압으로 .1 mL / min에서 용매 펌프를 시작합니다.
3. 질소 탱크를 30 psi로 설정하여 매트릭스 분무기로 압축 공기 흐름을 시작합니다. 그런 다음 분무기 전면의 압력 조절기를 10 psi로 조정하고 원하는 대로 분무기 노즐 온도를 설정합니다.
   참고: 기도의 기압이 5psi 미만인 경우 분무기 노즐은 보호를 위해 가열할 수 없습니다.
4. 밸브가 LOAD 위치에 있는 경우 주사기를 사용하여 7mL의 7mL메탄ol으로 루프를 플러시한 다음 6mL의 매트릭스로 루프를 채웁니다.
5. 조직 슬라이드를 분무기의 홀더에 배치하고, 양 끝을 테이핑하여 움직임을 방지하고, 매트릭스에 의해 MALDI 대상에 금속 클램프의 오염을 피하기 위해 매트릭스없는 가장자리를 보존한다.
   참고: 귀중한 샘플 슬라이드로 진행하기 전에 빈 현미경 슬라이드에서 먼저 매트릭스 스프레이를 테스트하는 것이 좋습니다.
6. 유량과 온도가 안정적으로 살포를 시작하도록 확인하십시오.
7. 빈 유리 슬라이드를 사용하여 미리 테스트된 원하는 방법을 선택합니다.
8. 시작을 누릅니다. 이렇게 하면 노즐 온도를 설정하고 펌프 유량을 조정하여 선택한 방법에 맞게 조정합니다. 밸브를 로드에서 스프레이 위치로 전환한 다음 계속을클릭하여 확인합니다.
9. 메서드에 따라 슬라이드당 5-20분정도 걸리는 시스템을 실행할 수 있습니다. 밸브를 스프레이에서 로드 위치로 전환한 다음 완료되면 계속을 클릭하여 확인합니다.
10. 분무기에서 슬라이드(들)를 제거하고 현미경하에서 매트릭스 코팅 패턴을 검사하여 미세 매트릭스 결정의 균일 한 층을 보장합니다.
11. 매트릭스 증착 후 슬라이드(들)를 금속 MALDI 홀더에 넣고 즉시 사용하십시오. 표본 슬라이드가 하나만 있는 경우 다른 빈 슬라이드를 추가하여 MALDI 홀더의 두 공백을 채웁니다.
12. 분무기 노즐의 막힘을 방지하기 위해 제조업체의 지시에 따라 사용 후 즉시 시스템을 정리합니다.
13. 샘플 슬라이드가 매트릭스로 코팅된 후 MALDI 이미징 기기로 즉시 진행하거나 2.19 단계에서 설명된 동일한 이중 지퍼 백 준비를 사용하여 드라이 아이스로 발송합니다.
    참고: MALDI 기기와 같은 비상 상황에서는 즉시 사용할 수 없으며, 코팅된 슬라이드를 진공 상태 또는 -20°C에 최대 24시간 동안 저장하지만 일부 대사산물의 열화는 저장 중에 발생할 수 있으며, 이는 철저히 연구되지 않았다.

대표적인 실험은 도 1에표시된 워크플로에 따라 수행하였다. 산후 1일, 21일, 60(성인)의 발달 C57BL 야생형 마우스 뇌는 CUNY IACUC 지침에 따라 상술한 바와 같이 수확되었으며 액체 질소에 떠있는 알루미늄 보트에 각각 2, 5 및 7 분 동안 얼어 붙었다. 동결된 조직은 표본 헤드와 챔버 모두에 대해 -15°C 의 10 μm 두께 섹션에서 냉동을 하였다. 조직 저온 섹션은 MALDI 이미징을 위해 ITO 코팅 유리 슬라이드의 미리 냉각된 전도성 측면으로 부드럽게 전달되었습니다. ITO 슬라이드에 장착된 냉동절은 실온에서 45분 동안 진공 상태에서 건조되었고, 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스 증착이 뒤따랐다. 매트릭스 NEDC는 대사 산물을 검출하는 데 사용되었으며, 메탄올/물(70/30, v/v)에서 10 mg/mL의 매트릭스 용액은 0.1mL/min의 유속및 75°C의 노즐 온도로 각 사이클 사이에 5s 건조를 가하는 데 사용하였다. 분무 속도 1,300mm/min, 트랙 간격 2mm, 10 psi의 N2 가스 압력 및 3 L/min의 유속 및 40mm의 노즐 높이가 사용되었습니다.

MALDI 질량 스펙트럼은 비행의 MALDI 시간 (TOF) MSI 악기에 의해 음의 이온 모드에서 획득되었다. 0.5-1 μL의 적색 인(n = 1 -90)의 에멀젼은 장착된 조직 옆에 있는 ITO 슬라이드에 증착되었고, 100-1000 m/z 질량 범위에서 계측기를 교정하는 데사용하였다. 레이저 스팟 직경은 50 μm 래스터 폭의 "중간" 변조 빔 프로파일에 초점을 맞췄습니다. m/z 50에서 1000까지의 질량 범위 내의 스펙트럼은 500발의 1000Hz에서 획득되었다. 질량 스펙트럼 데이터가 기록되었고, 이미징은 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석되었다. 이온 이미지는 루트 평균 정사각형(RMS) 정규화로 ±0.25 Da의 빈 폭으로 생성되었습니다.

그림 2의 결과는 100개의 달튼 간격에서 선택된 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어의 출력 영상을 보여 주며, 소분자 대사산물에서 고분자 량 지질에 이르는 스펙트럼을 식별하는 유틸리티를 명확하게 묘사합니다. 각 행은 산후 1, 21 및 60에서 수집된 3개의 조직에 걸쳐 특정 대사산물 종의 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함하는 각각의 이온 열지도를 묘사합니다. 각 대표 m/z에 대해, 지역 분포와 이온 풍부의 분석은 서로 다른 연령 사이의 해당 종의 상대적 양을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. MALDI MSI 방법론의 강도는 m/z에 의해 확인된 특정 종의 특이성을 발달 이정표 또는 특정 해부학 적 구조로 분별하는 능력입니다. 일부 대사 산물P1 신생아 (m/z 320.1), P60 성인 (m/z 846.5)에 농축 되 거나 연령에 걸쳐 균일 하 게 분포 하는 것으로 관찰 됩니다 (m/z 480.3); 다른 분자 종은 특히 회색 물질 (m/z 117.1; 524.3; 765.1), 백색 물질 (m/z 673.4; 846.5), 또는 CSF / 심실 (m/z 239.0)(그림 2A)에서농축된다. 저산소산틴(m/z 135.0), N-아세틸-L-아스파르트산(m/z 174.0), 아라치도니아산(m/z 303.2), 리소포스파일레탄탄민 LPE(18:18)와 같은 여러 지질을 포함한 대표적인 대사산물의 공간 분포(m/z 135.0), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE(22:6), (m/z 524.3), 포스파디에틸레탄올라민 PE(44:10) (m/z 838.5), 포스파디딜리노시톨 PI(38:4) (m/z 885.6)도2B(m/z885.6)를 나타내었다.

그림 1. MALDI- 비행 시간 (TOF) 질량 분광화상의 워크플로우. 스냅 냉동 조직은 냉동 저온에 극저고 ITO 슬라이드에 장착됩니다. → 조직 섹션슬라이드는 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스의 미세층으로 코팅된다. → 질량 스펙트럼은 20-200um의 래스터에서 MALDI-TOF MSI 기기에 의해 수집됩니다. → 데이터를 분석하고 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지가 생성됩니다. 스케일 바: 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 50 μm 측면 해상도에서 획득 된 질량 분석법에서 선택된 m / z 스펙트럼을 가진 대표 출력. (A)열지도는 P1, P21 및 P60에서 확인된 세 가지 발달 이정표에 걸쳐 100 달튼 m/z 간격마다 선택된 특정 대사산물 종의 공간 분포를 묘사한다. (B)P1, P21 및 P60에서 대표적인 대사산물의 공간 분포는 저산소산틴, N-아세틸-L-아스파르트산, 아라치도닉산, 리소포스파디들레타놀라민(LPE), 포스파디들레탄올라민(PE), 포스파디에틸다민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라인탄아민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탈탄아민(PE), 포스파디딜라탈탄올라민(PE), 포스파디딜라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탈라민(PE), 포세파다틸다탈라민(PE), 포세파틸다탈라민(PE), 포자측피톨라민(PE), 포세틸다딜라네민(PE), 포세이다딜라민(PE), 포 스케일 바, 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.