마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

부적절한 상처 치유를 가진 피부 궤양은 인간 환자 1에서 절단의 주요^{원인입니다.} 적절한 상처 치유는 말초 동맥 질환 환자에서 손상되는 손상되지 않은 피부를 유지하는 데 필요한 것보다 더 높은 수준의 동맥 관혈이 필요하며,^{이는 말초}동맥 질환^2,3,4. 몇몇 그밖 류마토로피 상태 및 당뇨병은 또한 상처를 치유하기 위하여 방해되고 부적당한 피부 미세 순환으로 이끌어 낼 수 있습니다^5,6. 많은 당뇨병 환자는 수반되는 말초 동맥 질병이 있어 절단을 위한 특히 높은 위험에 그(것)들을 두습니다. 레이저 도플러 관류 영상(LDPI)은 임상 적 상황에서 피부 미세 순환을 평가하는 데 사용되며, 실험적인 뒷다리 허혈, 허혈-재침투 및 미세수술 플랩⁷후혈 및 혈류 회복을 평가하는 연구 상황에서도 사용된다.

LDPI 시스템은 스캐닝 미러에 의해 편향된 저전력 레이저 빔을 투사하여 관심 영역을 넘어이동합니다. 이는 레이저 도플러 유동측정과 는 다르며, 이는 유량^{탐사프로브(8)와}직접 접촉하여 조직의 작은 영역에 대한 관류 측정을 제공한다. 레이저 빔이 미세 혈관에서 움직이는 혈액과 상호 작용할 때, 스캐너에 의해 감지되고 임의 관류 단위로 변환되는 도플러 주파수 이동을 겪습니다. LDPI는 광기반 기술이기 때문에 침투 깊이가 0.3-1mm로 제한되어 있으며, 이는 대부분의 경우 진피 관류가^7을평가한다는 것을 의미합니다. 진피 흐름은 피부 온도 및 교감 신경계에 의해 변경될 수 있으며, 이는 다양한^{마취제(9)에}의해 영향을 받을 수 있다. 광학 레이저의 측정은 주변 조명 조건, 피부 색소 침착의 영향을 받으며 털이나 모발^7을과도하게 차단할 수 있다.

LDPI는 비침습적이고, 대비 투여가 필요하지 않으며, 여러 동물에 대한 데이터 수집을 허용하는 빠른 스캔 시간을 가지고 있기 때문에 허혈 후 관류 회복을 모니터링하는 데 가장 일반적으로 사용되는 연구 기술입니다. 이것은 치료 동맥 발생 또는 혈관 신생을 겨냥한 처리가 작은 동물 모형에서 효과적인지 결정하는 것을 돕도록 이상적입니다. LDPI에 의해 측정된 힌드래지 허혈 후의 혈류 회복은 마이크로필 주조 또는 마이크로 CT^10,11과같은 다른 수단에 의해 평가될 때 부수적 동맥 발달과 잘 상관관계가 있다. 이 프로토콜의 목표는 LDPI를 사용하여 뒷다리 관류의 평가를 입증하는 것입니다.

동물 실험은 워싱턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 스캐너 준비

1. 스캔된 피사체까지의 거리가 약 30cm되도록 스캐너 높이를 조정합니다.
2. 이미저를 켜고 관련 소프트웨어를 시작합니다.
3. 측정 프로그램을 엽니다. 소프트웨어가 스캐너와 올바르게 통신하는 경우 경고의 적외선 레이저 턴이 나타납니다.
4. 제조업체가 제공한 표준으로 컴퓨터를 보정합니다(비디오에 표시되지 않으며 사용되는 컴퓨터의 특정 모델에 따라 다릅니다).
5. 스캐너 설정을 조정하여 방의 배경 재료 및 조명 설정에 적합합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 게인 수준 DC FLUX 및 CONC를설정합니다(비디오에 표시되지 않음).
   2. 검은 색 배경 재질의 레이저 빔을 가리키며 배경 임계값을 설정하고 자동 BK 세트를누릅니다.

2. 마우스 사전 스캔 준비

1. 폐가스를 적절히 청소하여 이소플루란 유도챔버를 설치한다.
   참고: 실내막챔버를 온난화 패드에 배치하면 마취 유도 중 마우스 온도 손실을 방지하는 데 도움이 됩니다.
2. 비반사 표면 아래의 스캐닝 영역에 배치되는 홈더믹 담요를 켭니다(이 경우 검은 네오프렌 패브릭). 37°C의 체온을 유지하기 위해 홈더믹 담요를 설정합니다.
3. 가정용 담요와 윤활유에 대한 온도 프로브를 배치하여 삽입할 준비가 되어 있습니다.
4. 마취 마스크와 청소 시스템을 스캔 영역에 배치합니다.
5. 이소플루란 기화기로 마우스를 마취시화합니다. 산소 속도를 1 L/min의 흐름으로 설정하고 마취 유도를 위해 이소플루란을 4%로 조정합니다. 마취 유도 챔버로의 흐름을 켜면 마우스 호흡 속도가 느려집니다. 마우스가 오른쪽 반사반사를 잃을 때 적절한 마취가 달성됩니다.
6. 마우스를 마취 마스크/코 콘에 부착된 폐가스 청소부로 옮기고 이소플루란을 1.5%로 조정합니다.
   참고 : 이 마취 수준은 일반적으로 스캔 하는 동안 상대적으로 가만히 누워 마우스를 유지 하기 에 적합, 하지만 마취의 수술 수준을 제공 하기 위한 되지 않습니다., 그래서 마취의 깊이 확인 되지 않습니다. 이소플루란 수준을 변경하면 심장 박동, 호흡 및 진피 관류의 변화가 발생하므로 모든 시간 과정 실험과 모든 실험 과목에 일관된 백분율을 사용해야 합니다. 케타민 자일라진의 IP 주입과 같은 대체 마취 기술도 사용할 수 있지만, 다른 마취제가 다른 마취제가 다르게 진피 관류에 영향을 미치기 때문에 모든 시간 과정 연구 전반에 걸쳐 동일한 마취 기술을 사용해야 합니다.
7. (스캔 영역에 따라 선택 사항) 스캔할 관심 영역이 모피로 덮여 있는 경우 작은 전기 트리머 또는 탈필 크림을 사용하여 관심 지역에서 머리카락을 제거하십시오.
   참고: 탈모 크림은 완전히 제거되어야 하며 스캔 하기 전에 마우스 피부건조.
8. 홈더믹 담요를 덮고 있는 검은 색 비반사 표면에 마우스를 적절한 스캐닝 위치에 놓고, 두 뒷다리가 평형 및 스캐닝(그림1)을통해 열원에 남아 있음을 확인한다.
   참고: 온도의 지역적 변화를 방지하기 위해 홈더믹 담요에 두 발을 유지하는 것이 중요합니다.
9. 홈더믹 담요와 관련된 윤활유 직장 온도 프로브를 삽입합니다.
10. 마우스 온도를 원하는 스캐닝 온도(37°C)에 상응하여줍니다. 약 5-10 분.
11. 상단 메뉴 또는 스캐너 설정 아이콘에서 액세스할 수 있는 스캐너설정을 선택합니다. 관심 영역을 수용하기 위해 X-Y 좌표를 변경하여 스캔 영역을 조정합니다. 스캔 속도는 스캔 해상도에 따라 달라집니다. 해상도가 높을수록 스캔 시간이 길어집니다. 해부학 적 관류에 초점을 맞춘 높은 해상도와는 달리 글로벌 관류에 초점을 맞춘 반복 스캐닝의 경우 4 ms /픽셀의 스캔 속도가 적절합니다.
    참고: 연구원이 개발 중인 부수적 순환을 직접 연구하려고 시도하는 경우 더 높은 해상도와 단일 검사를 고려해야 합니다(피부에 가까운 복부 허벅지와 종아리에서 가장 잘 이미지된 것). 마우스 풋패드의 최종 기관에 대한 글로벌 관류를 평가할 때 낮은 해상도/속도(예: 4 ms/pixel)에서 반복스캔이 적절합니다. 비디오에 표시된 소프트웨어는 다시 시작할 때 스캔 영역, 속도 및 해상도에 대해 이전에 사용한 템플릿을 자동으로 로드하거나 다양한 실험에 다른 관심 영역을 사용하는 경우 저장된 파일에서 검색할 수 있습니다.
12. 반복 검사를 수행하는 경우 반복 및 줄 스캔 탭을 선택합니다. 검사 횟수(이 경우 3스캔)와 반복 간격을 변경할 수 있습니다. 반복 간격의 최소 시간은 스캔 영역 및 스캔 해상도에 의해 결정된 상자 오른쪽의 회색 아웃 영역에 표시되는 예상 스캔 시간입니다. 몇 초를 추가하면 사용자가 일시 중지하고 스캔 사이에 필요한 경우 마우스를 재배치할 수 있습니다.

3. 스캔

1. 이미지 스캔 탭을 선택하고 마크 버튼을 선택합니다. 레이저는 스캔 영역을 설명하기 위해 이동합니다. 스캔할 대상이 표시된 영역 내에 있도록 마우스 위치를 조정합니다.
   참고: 풋패드 나 풋패드 및 종아리 스캔의 경우, 뒷다리로 포지셔닝하는 경향이 있는 위치는 supine 포지셔닝보다 더 일관된 관심 영역을 제공합니다. 대퇴동맥과 사페누스 동맥 및 담보는 허벅지와 종아리의 복부 표면에 매우 가깝기 때문에 이러한 관심 영역을 사용하는 경우 supine 포지셔닝이 바람직합니다.
2. 반복 검색 아이콘을 선택하여 반복 측정을 시작하고 재생 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다.
3. 팝업 창에서 스캔 거리를 확인하고 확인을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
4. 마우스 움직임을 스캔하는 동안 마우스를 모니터링; 마우스가 검색 중간에 있는 스캐닝 영역에 힌드포스가 더 이상 없을 것으로 충분히 이동하면 검사를 다시 시작합니다. 마우스 힌드포 위치의 작은 변형은 분석 소프트웨어에서 수용할 수 있습니다.
5. 홈더믹 담요를 사용해도 변동될 수 있으므로 스캐닝 과정에서 마우스 온도를 모니터링합니다. 마우스 온도에 너무 많은 변화가 있는 경우 스캔 간에 상당한 변화가 발생할 수 있습니다. 일반적으로 온도 범위는 36.8-37.2°C로 허용 가능한 데이터를 생성합니다.
6. 캡처된 스캔을 저장창 아래에 마우스 식별자와 시간점을 포함하는 파일 이름을 사용하여 저장하여 데이터 분석을 쉽게 수행합니다. 제목 세부 정보 창에서 원하는 경우 마우스 및 타임포인트 세부 정보를 입력합니다.
7. 이소플루란을 끄고 직장 온도 프로브를 제거합니다.
8. 직장 온도 프로브를 70% 에탄올로 소독하여 다음 마우스에서 사용할 수 있습니다.
9. 마우스가 마취에서 회복하여 수핀 위치에서 케이지로 되돌리기 전에 경향이 있는 위치로 뒤집어 오른쪽 반사반사를 표시하는 지점까지 마우스를 회수할 수 있도록 합니다.
   참고: 회복은 매우 빠르거나 케타민/자일라진을 위한 따뜻한 회복 케이지에서 이소플루란을 위한 온난화 담요에서 수행될 수 있습니다.

4. LDPI 데이터 캡처(그림 3)

1. 이미징 검토 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
2. 파일 메뉴로 이동하여 저장된 파일을 열고 찾습니다.
3. 도구 모음에서 ROI 아이콘을 선택합니다.
4. 다각형 추가 버튼을 선택합니다.
5. 마우스를 사용하여 제어 뒷다리에 대한 관심 영역(ROI)을 추적합니다. 회색 배경이 계산된 평균에 포함되지 않으므로 다각형 추적이 정확할 필요는 없습니다.
6. 수술 뒷다리에 대한 4.3-4.5 단계를 반복합니다.
7. 통계 아이콘을 선택하여 이미지 ROIs 통계 결과(PU) 창을 엽니다.
8. 다각형 1(제어 뒷다리) 및 다각형 2(수술 뒷다리)의 결과를 복사/붙여넣기를 통해 데이터 수집 워크시트로 내보냅니다.

5. 분석

1. 각 검사에 대해 데이터를 외과/제어 비율로 캡처합니다.
2. 해당 시점에서 해당 특정 마우스의 데이터 포인트에 대해 세 검사 모두에 평균 수술/제어를 사용합니다. 힌드래지 허혈에 대한 반응에서 생물학적 가변성 으로 인해 일반적으로 8-10 마우스는 시간당 ~10 % 표준 오류로 재현 가능한 결과를 달성해야합니다.
   참고: 마우스가 마취에서 복구하도록 허용하기 전에 반복 된 스캔을 신속하게 분석하여 데이터가 너무 가변인지 확인하는 것이 좋습니다 (예 : 스캔 1-3 사이에 다른 100-150 개 이상의 관류 단위). 반복 스캔 사이의 높은 변형은 마우스가스캔(그림 2)동안 완전히 평형화되지 않았음을 시사하며, 나중에 이미지가 나중에 분석되지 않으면 발생하는 데이터 점을 잃지 않고 반복 스캔을 수행할 수 있음을 시사한다. 표시된 플럭스 값의 동적 범위를 최적화하기 위해 색상 팔레트를 변경하면 스캔 변형을 더 잘 표시할 수있습니다(그림 2).

성공적인 LDPI는 3개의스캔(그림 2)사이에100-150개 이하의 관혈 단위 변이(마우스 풋패드에 대한 일반적인 평균 관류의 약 10%에 해당)를 초과하지 않는 일관된 반복측정 검사의 결과를 초래해야 한다. 도 2에서설명한 바와 같이, 반복 검사는 마우스가 적절하게 평형되어 허혈성/대조비가 온도 변화로 인한 진피 관류의 변화와 는 달리 근본적인 혈류를 가장 잘 반영하도록 결정하는 데 도움이 된다. 데이터 포인트에 단일 스캔을 사용하면 더 많은 실험 마우스가 필요합니다. 뒤다리 허혈에 사용될 때, 외과 뒷다리는 통제 뒷다리에 비해 글로벌 관류를 감소시켜야 합니다. 결과는 외과 뒷다리 관류/제어 뒷다리 관류의 비율로 표현됩니다. 마우스는 처음에 시간이 지남에 따라 본질적인 부수적 네트워크를 병지및 개발함에 따라, LDPI에 의한 혈류 회복은 수술 후 시간과정(그림 4)을통해 볼 수 있어야 한다. 회복 정도는 마우스 변형률과 뒷다리 허혈 모델의 심각도에 의존한다.

그림 1. 복부 풋패드의 레이저 도플러 관류 이미징용 마우스 포지셔닝. 이소플루란 코 콘(A)을 이용한 마취 마우스는 복부 풋패드의 스캔을 허용하기 위해 뒷다리가 확장된 경향이 있는 위치에 배치된다. 홈더믹 담요에 대한 직장 온도 프로브 (P)는 스캔 중에 일관된 체온을 유지하기 위해 제자리에 있습니다. 홈더믹 담요 패드는 스캔을위한 배경을 제공하는 데 사용되는 반사되지 않는 네오프렌 재료 아래에 있습니다. 스캐닝 영역의 중간을 나타내는 레이저는 마우스의 꼬리 옆에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 마우스 온도 변화에서 스캔 변화의 데모 는 색상 팔레트 조정으로 더 잘 볼 수 있습니다. (A)레이저 도플러는 반복된 플럭스 스캔에서 색으로 변환된 관류 단위를 기반으로 볼 수 있는 반복 스캔 중 마우스 코어 온도 변화에 의한 상당한 변동으로 스캔을 반복하였다. (B)A에서 0-1000(빨간색 화살표)에서 0-1000(빨간색 화살표)으로 색상 팔레트(스캔 창 의 왼쪽에 도시됨)의 동적 범위를 변경하면 변화가 더욱 분명해집니다. (C)대조군 뒷다리(A와 B의rfx 이미지에 검은색으로 폴리곤 1)에 대한 관심 영역(빨간색으로 동그라미)에 대한 평균 관류 값을 나타내는 통계는3rd 스캔에서 791로1st 스캔에 대해 655 사이이며 평균 관류에 대한 의미 관류 값을 제공합니다. 허혈성 힌드림에 대한 관심 영역(A 및 B의rfx 이미지에 빨간색으로 다각형 2)은 적은 변형(361 에서 400)을 보였으며, 반복 스캔(0.60, 0.53) 사이의 허혈/제어 비율에 상당한 차이를 이끌어 내고, 및 0.46). (D)윈도우측정 소프트웨어(왼쪽 패널) 및 이미지 검토 소프트웨어(오른쪽 패널)에서 색상 팔레트의 동적 범위를 변경합니다. 빨간색 화살표는 상범위를 늘리거나 줄이는 위치를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 반복 스캔레이저 도플러 관류 이미징을 위한 데이터 캡처. (A)1이 있는 최고 도구 모음. ROI 아이콘을 추가합니다. 2. 다각형 아이콘을 추가합니다. 3. 제목 세부 정보 아이콘 (B에서창 팝업에 액세스). 4. 통계 아이콘 (C에서창 팝업에 액세스). (B)주제 세부 사항 창. (C)각 ROI에 대한 평균 관류 값(빨간색으로 동그라미)을 나타내는 통계 창입니다. (D)다각형 ROI가 있는 반복 스캔은 제어 힌드포(black) 및 허혈성 힌드포(빨간색)를 중심으로 추적된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. LDPI 데이터를 사용하여 시간 과정 실험. P27 녹아웃 마우스 (3-5 개월 된 여성 CDKN1b-/- C57Bl/6 배경에 마우스) 대퇴 동맥 결찰 후 (n=6) 및 없이 (n=10) 경구 독실성 치료 나이 일치 여성 야생형 C57Bl/6 마우스 (n=11) 및 없이 (n=11) 및 없이 (n=9) 구두 를 발간하는 비사용 오류 막대는 평균(SEM)의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탕 박사는 공개할 이해상충이 없습니다.