이 프로토콜은 면역 형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 해부 된 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
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방법 논문
면역 형광을 사용하여 제브라피시 배아 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
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이 논문에서
요약
초록
주변 의 미세 미립자 물질 (PM2.5)노출은 심장 발달 독성으로 이어질 수 있지만 기본 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 8-하이드록시-2'탈산소제(8-OHdG)는 산화 DNA 손상의 마커이며 γH2AX는 DNA 이중 가닥 파손에 대한 민감한 마커이다. 이 연구에서는 면역형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM2.5-유도8-OHdG 및 γH2AX 의 변화를 검출하는 것을 목표로 했습니다. Zebrafish 배아는 2h 후 수정(hpf)에서 항산화 N-아세틸-L-시스테인(NAC, 0.25 μM)의 존재 또는 부재 시 PM2.5에서 추출 가능한 유기 물질(EOM)으로 치료되었다. DMSO는 차량 제어로 사용되었습니다. 72 hpf에서, 심혼은 주사기 바늘을 사용하여 배아에서 해부되고 고정되고 permeabilized되었습니다. 차단 된 후, 샘플은 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1 차 적인 항체로 조사되었다. 시료는 그 때 세척하고 이차 항체로 배양하였다. 결과 심상은 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되고 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다. 결과는 PM2.5에서 EOM이 제브라피시 배아의 심장에 있는 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 현저하게 향상했다는 것을 보여줍니다. 그러나, NAC는 반응성 산소 종(ROS) 폐포제로 작용하여 EOM 유도 DNA 손상을 부분적으로 중화하였다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아의 심장에서 환경 화학 유발 단백질 발현 변화의 검출에 적용될 수 있는 PM2.5-유도된심장 결함에서 DNA 손상의 역할을 조사하기 위한 면역형성 프로토콜을 제시한다.
서론
대기 오염은 이제 세계가 직면한 심각한 환경 문제입니다. 대기질의 가장 중요한 지표 중 하나인 주변 미세미립자 물질(PM2.5)은많은 유해 물질을 운반하고 혈액 순환 시스템에 들어갈 수 있어 인체 건강에 심각한 해를 끼칠 수있다 1. 역학 연구는 PM2.5 노출이 선천성 심장 결함 (CHDs)2,3의증가한 리스크로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여주었습니다. 동물 실험에서 증거는 또한 PM2.5가 제브라피시 배아와 마우스의 자손에서 비정상적인 심장 발달을 일으킬 수 있지만 PM2.5의 심장 발달 독성의 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려지지 않은4,5,6을보여주었다.
DNA 손상은 세포 주기 체포를 유발하고 세포 세포의 잠재력을 광범위하게 파괴할 수 있는 세포 세포 멸망을 유발할 수 있으며, 결과적으로 심장발달7을<....
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프로토콜
이 연구에 사용된 야생형 제브라피쉬(AB)는 중국 우한에 있는 국립 제브라피시 자원 센터에서 입수되었다. 여기에 설명된 모든 동물 절차는 소오하우 대학 윤리위원회의 동물 관리 기관에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. PM2.5 샘플링 및 유기 화합물 추출
참고: PM2.5는 2015년 8월 1일부터 7일까지 중국 쑤저우의 한 도시 지역에서 수집되었으며, 이전에 설명한 대로5.
- 유기 성분을 제거하기 위해 2 시간 동안 500 °C 머플 로에 47mm 석영 멤브레인 필터를 굽습니다.
- 중단 없는 샘플링을 위해 PM2.5 샘플러에 필터를 놓습니다.
- 필터를 제거하고 실온에서 24 시간 동안 건조하십시오.
- 분석 균형으로 필터를 정량화합니다.
- 용매(19)로서디클로로메탄을 이용한 소슬렛 추출에 의해 필터로부터 유기 성분을 추출한다.
- 60°C 수조 및 질소 흐름에서 회전 증발에 의해 EOM을 건조시. DMSO에서 EOM을 용해하고 -20 °C에 저장합니다.
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결과
이러한 면역형분석법은 환경 화학물질에 노출된 제브라피시 배아의 심장에서 단백질 발현 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다.
본 대표적인 분석에서, 항산화 NAC의 부재 또는 존재시 PM2.5에 노출된 배아는 심장 기형의 존재에 대해 평가하였다(도1). 관찰된 바와 같이, PM2.5로부터EOM은 DMSO 대조군 처리심장에 비해 심근 부종, 변경된 루핑 및 감소된 크기와 같은 심장 성각발생에 상당한 증가를 일으켰습니다. 심장 박동 속도는 또한 EOM(도 1B)에노출된 배아에서 현저하게 감소되었습니다. NAC의 첨가는 EOM 유발 심장 결함을 현저히 감쇠시켰다(도1).
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토론
제브라피쉬는 환경 화학물질의 심장 발달 독성을 연구하기 위한 우수한 척추동물 모델이지만, 배아 심장의 크기가 작기 때문에 서양 얼룩 분석을 위한 충분한 단백질을 얻기가 어렵다. 따라서, PM2.5에노출된 제브라피쉬 배아의 심장에 DNA 손상 바이오마커의 단백질 발현 수준을 정량화하기 위한 민감한 면역형광방법을 제시한다.
해부 동안, 마음의 무결성을 온전하게 유지하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에서, 그것은 상대적으로 쉽게 72 hpf에서 격리를 수행. 또한 수집 후 가능한 한 빨리 고정 솔루션에 심장을 넣어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 해부된 하트가 유리 슬라이드에 완전히 부착되어 있는지 확인하기 위해 샘플을 건조시키는 것입니다. 그렇지 않으면 라벨링 중에 샘플이 슬라이드에서 세척될 수 있습니다.
이중 면역형광 염색은 고립된 심혼에서 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 모두 검출하기 위해 수행됩니다. 이 방.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 : 81870239, 81741005, 81972999)과 장쑤 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG 항체 | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | 1 차 항체 |
| 분석 저울 | Sartorius, 중국 | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, 베이징, 중국 | SW3015 | |
| DAPI | Abcam 차단, 미국 | ab104139 | 핵 카운터 스테인. |
| DMSO | Solarbio, 베이징, 중국 | D8371 | |
| 형광 현미경 | 올림푸스, 일본 | IX73 | 형광 신호 이미징 / |
| 염소 안티 토끼 IgG Cy3 | 칼즈배드, 미국 | CW0159 | 2 차 항체 |
| 염소 안티 토끼 IgG FITC | 칼즈배드, 미국 | RS0003 | 2 차 항체 |
| N- 아세틸 -L- 시스테인 (NAC) | 아다마스-베타, 상하이, 중국 | 616-91-1 | |
| 궤도 셰이커 | QILINBEIER, 중국 | TS-1 | |
| 파라 포름 알데히드 | 시그마, 중국 | P6148 | 고정을 위해 4 % 파라 포름 알데히드를 만듭니다. |
| 인산염 완충 식염수 | HyClone, 미국 | SH30256.01 | 세척을 위해 PBS에 0.1% 트윈을 준비합니다. |
| PM2.5 샘플러 | TianHong, 우한, 중국 | TH-150C | 24시간 중단 없는 PM2.5 샘플링용. |
| 재순환 양식 시스템 | HaiSheng, Shanghai, China | 얼룩말이 그 안에서 유지되었습니다. | |
| Soxhlet 추출기 | ZhengQiao, 상하이, 중국 | BSXT-02 | 유기 성분 추출용. |
| 실체 현미경 | Nikon, Canada | SMZ645 | 제브라피시 배아의 심장 박리용. |
| 트리카인 메탄설포네이트 (MS222) | 시그마, 중국 | E10521 | 제브라피쉬 배아 |
| Tween 20 | Sigma, 중국 | P1379 | |
| &gamma를 마취하기 위해; H2AX 항체 | Abcam, USA | ab26350 | 일차 항체 |
참고문헌
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
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재인쇄 및 허가
