세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

요약

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

초록

단일 세포 배열의 라이브 셀 이미징 (LISCA)는 높은 처리량의 개별 세포로부터 형광 신호의 시간 과정을 수집하는 다양한 방법입니다. 일반적으로, 배양 된 세포에서 단세포 시간 과정의 취득은 세포 운동성 및 세포 모양의 다양성에 의해 방해된다. 접착제 마이크로 어레이는 단일 셀 조건을 표준화하고 이미지 분석을 용이하게 합니다. LISCA는 단일 셀 마이크로어레이와 스캔 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 처리를 결합합니다. 여기서는 LISCA 형식으로 단일 세포 형광 시간 과정을 취하는 실험 단계를 설명합니다. 당사는 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 위해 mRNA 인코딩을 사용하여 마이크로패턴 어레이에 부착된 세포를 트랜스펙트하고 스캔 시간 경과 현미경 검사를 통해 수백 개의 세포의 eGFP 발현 운동을 병렬로 모니터링합니다. 이미지 데이터 스택은 선택한 셀 윤곽에 형광 강도를 통합하여 단일 세포 형광 시간 과정을 생성하는 새로 개발된 소프트웨어에 의해 자동으로 처리됩니다. 우리는 mRNA 이식 후 eGFP 발현 시간 과정이 mRNA의 발현 및 저하 율을 드러내는 간단한 운동 번역 모델에 의해 잘 설명된다는 것을 보여줍니다. 사멸 신호의 맥락에서 여러 마커의 이벤트 시간 상관 관계에 대한 LISCA의 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

서론

최근 몇 년 동안, 단세포 실험의 중요성이 명백해지고 있다. 단일 세포로부터의 데이터는 세포 대 세포 가변성, 세포 내 파라미터 상관관계의 해상도 및 앙상블 측정^1,2,3에숨겨져 있는 세포 역학의 검출을 조사할 수 있다. 수천 개의 단일 세포의 세포 역학을 병렬로 조사하기 위해서는 수 시간까지 며칠 동안 표준화된 조건하에서 세포를 모니터링할 수 있도록 하는 새로운 접근법이 필요하며, 이어서 정량적 데이터 분석 ^4. 여기서는 미세구조화 어레이의 사용과 시간 경과 현미경 검사및 자동화된 이미지 분석을 결합한 단일 셀 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징을 소개합니다.

미세 구조화 된 단세포 어레이를 생성하기위한 몇 가지 방법이 수립되어 문헌^5,6에출판되었다. 여기에서, 우리는 마이크로 스케일 플라즈마 개시 단백질 패턴화 (μPIPP)를 간단히 설명합니다. μPIPP를 이용한 단일 세포 어레이 제조의 상세한 프로토콜도 참조

프로토콜

그림 2: 단일 세포 마이크로 어레이 (A)와 스캔 시간 경과 현미경 검사 (B)를 결합한 데이터 수집. 시간 경과 실험의 준비로서, 접착 사각형의 2D 마이크로패턴을 가진 단일 세포 어레이가 제조(1), 세포 파종 및 마이크로패턴(2)에 세포의 정렬뿐만 아니라 6채널 슬라이드에 관류 시스템의 연결, 이는 시간 경과 측정(3) 동안 액체 처리를 가능하게 한다. 스캐닝 타임랩스 실험이 설정되고(4) 세포는 시간 경과 실험(5) 동안 관류 시스템을 통해 mRNA 리포플렉스 용액을 주입하여 현미경에 전염된다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 미세 구조화 된 단세포 배열 제작(그림 2A)<....

결과

LISCA 접근 은 단일 세포에서 형광 시간 과정을 효율적으로 수집 할 수 있습니다. 대표적인 예로, LISCA 메서드가 트랜스펙트 후 단일 셀 eGFP 식을 측정하기 위해 어떻게 적용되는지 설명합니다. LISCA 실험의 데이터는 효율적인 mRNA 약물의 발달에 중요한 mRNA 전달 운동학을 평가하기 위해 사용됩니다.

특히 우리는 단일 세포 수준에서 번역 개시 및 발현 속도에 대하여 2개의 지질 계 mRNA 전달 시스템의 상이한 충격을 보여줍니다. 우리는 세포를 배양하고 배치를 두 집단으로 나누었습니다. 하나의 하위 인구는 프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이 lipoplexes로 전감염되었다. 다른 하위 인구는 동일한 최종 mRNA 농도를 가진 동일한 mRNA를 사용하여 전염되었지만, 지질 나노입자(LNP)를 전달 시스템으로, 미세유체^{혼합(12)을}사용하여 생산되었다. lipoplexes 및 LNPs의 mRNA 전달 시스템의 다른 지질 조성.......

토론

여기서 우리는 LISCA를 단세포 수준에서 세포내 형광 라벨의 세포 역학을 따르는 다목적 기술로 기술했습니다. 성공적인 LISCA 실험을 수행하려면 프로토콜 섹션의 각 설명된 단계를 개별적으로 수립해야 하며 모든 단계를 결합해야 합니다. LISCA의 세 가지 주요 측면은 각각 중요한 단계를 특징으로합니다.

단세포 마이크로어레이 제작
마이크로어레이의 셀룰러 정렬은 모든 추가 실험 단계에 중요할 뿐만 아니라 데이터 품질에도 영향을 미치기 때문에 마이크로어레이의 품질이 중요합니다. 이러한 이유로 패턴 및 제조 방법의 형상은 사용된 셀에 대해 조정되어야 합니다. 본 문서에서 논의된 대표적인 결과는 (30 μm) 2제곱패턴에 정렬된 간 암종 세포주 HuH7로 생성되었다. 이 패턴 지오메트리는 A549 또는 HEK293과 같은 다른 세포주에도 적합합니다. BEAS-2B와 같은 더 큰 셀의 경우 35 μm 가장자리 길이와 80 μm의 사각 거리와 더 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
애드텍 폴리머 엔지니어링 PTFE 마이크로튜빙	Fisher Scientific	10178071
베이킹 오븐	바인더	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Desiccator	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Female Luer to Tube Connector	MEDNET	FTL210-6005
태아 소 세럼	Thermo Fisher	10270106
Fibronectin	Yo Proteins	663
필터 세트 eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand  반투명 백금 경화 실리콘 튜빙	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1M)	Thermo Fisher	15630080
인큐베이션 박스	Okolab	OKO-H201
인큐베이터	바인더	9040-0012
L-15 페놀 레드 없음	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher
남성 Luer			플론
, 남성 Luer-튜브 커넥터,	MEDNET	MTLS210-6005	사내에서 제작 된 남성 Luer에 대한 대안
NaCl (5M),	Thermo Fisher	AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector,	MEDNET,	NVFMLLPC
, NIS 요소	, Nikon으로 제작		이미징 소프트웨어 버전 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	튜브 시스템 어셈블리용 고속 경화 광학 접착제
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
Phosphate buffered Saline (PBS)			In-house prepared
Plasma Cleaner	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
실리콘 웨이퍼 mit mircorstructures			자체 제작
Sola Light Engine	Lumencor
스티키 슬라이드 VI 0.4	ibidi	80608
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Dow Corning	1673921
Tango 2	Mä rzhä user	00-24-626-0000
초순수			사내 준비
된 코팅되지 않은 커버 슬립	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	교체 스포르노 포함

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