우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
동방 결절 (SAN)의 심박 조율기 세포에 의해 생리 학적으로 생성 된 전기 신호는 방실 결절 (AVN)을 포함하는 전도 시스템을 통해 전도되어 전체 심장의 흥분과 수축을 허용합니다. SAN 또는 AVN의 기능 장애는 부정맥을 유발하여 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 근본적인 역할을 나타냅니다. 마우스 모델은 부정맥 연구에 널리 사용되지만 SAN 및 AVN에 대한 구체적인 조사는 여전히 어렵습니다.
SAN은 상대 정맥과 크리스타 터미널의 교차점에 위치하고 AVN은 관상 동맥, 삼첨판 고리 및 Todaro의 힘줄의 구멍에 의해 형성된 Koch의 삼각형의 정점에 위치합니다. 그러나 크기가 작기 때문에 기존 조직학에 의한 시각화는 여전히 어렵고 3D 환경 내에서 SAN 및 AVN을 연구할 수 없습니다.
여기에서는 라벨링된 마우스 SAN 및 AVN의 로컬 시각화를 허용하는 전체 마운트 면역형광 접근법에 대해 설명합니다. 전체 마운트 면역형광 염색은 수동 절편이 필요 없는 조직의 더 작은 부분을 위한 것입니다. 이를 위해 마우스 심장을 해부하고 원치 않는 조직을 제거한 다음 고정, 투과 및 차단합니다. SAN 및 AVN 내의 전도 시스템의 세포는 항 -HCN4 항체로 염색됩니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 이미지 처리를 통해 결절 세포와 작동하는 심근 세포를 구별하고 SAN과 AVN을 명확하게 국소화할 수 있습니다. 또한, 추가 항체를 결합하여 신경 섬유와 같은 다른 세포 유형도 표지 할 수 있습니다.
기존의 면역 조직학과 비교하여 전체 마운트 면역 형광 염색은 심장 전도 시스템의 해부학 적 무결성을 보존하여 AVN을 조사 할 수 있습니다. 특히 해부학 적 구조와 주변의 작동하는 심근 및 비 근육 세포 세포와의 상호 작용에 대해서도 마찬가지입니다.
서론
부정맥은 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 질병이며 전 세계적으로 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 심장 박동기의 개발과 같은 치료 및 예방의 엄청난 발전에도 불구하고 부정맥 치료는 주로 근본적인 질병 메커니즘에 대한 지식이 매우 제한적이기 때문에 여전히 어렵습니다 1,2,3. 정상적인 전기 생리학과 부정맥의 병태생리학을 더 잘 이해하면 미래에 새롭고 혁신적이며 인과 관계가 있는 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 부정맥 발생을 종합적으로 연구하려면 마우스가 전기 생리학 연구에 널리 사용되기 때문에 마우스와 같은 동물 모델에서 특정 심장 전도 시스템을 국소화하고 시각화하는 것이 중요합니다.
심장 전도 시스템의 주요 부분은 특수 심박 조율기 세포에서 전기 충격이 생성되는 동방 결절 (SAN)과 심방과 심실 사이의 유일한 전기적 연결 인 방실 결절 (AVN)입니다4. SAN과 AVN의 전기 생리 학적 특성이 변경 될 때마다 아픈 부비동 증후군이나 방실 차단과 같은 부정맥이 발생하여 혈역학 적 악화, 실신 및....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨 바이에른 정부의 승인을 받았습니다(ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J 마우스는 잭슨 연구소로부터 구입하였다.
참고: 그림 1 은 실험에 필요한 기기를 보여줍니다. 도 2 는 총 심장 해부학의 그림을 나타낸다. 도 3 은 성인 마우스 심장에서 SAN 및 AVN의 위치를 나타낸다. 도 4 는 공초점 현미경에 로딩된 준비된 샘플을 나타낸다.
1. 준비
- PBS 30mL에 16% 포름알데히드 용액 10mL를 희석하여 4% 포름알데히드 용액(4% PFA)을 준비합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 SAN과 AVN 모두의 컨포칼 현미경 이미징을 안정적으로 수행할 수 있습니다. HCN4를 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 전도 시스템의 특정 염색과 Cx43을 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 작동 심근의 염색을 통해 온전한 해부학 내에서 SAN (그림 5, 비디오 1) 및 AVN (그림 6, 비디오 2)을 명확하게 식별할 수 있습니다.
그림 1:.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
심장 해부학은 전통적으로 얇은 조직 학적 섹션11을 사용하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 전도 시스템의 3차원 구조를 보존하지 않으므로 2D 정보만 제공합니다. 여기에 설명된 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 사용하면 이러한 한계를 극복할 수 있으며 SAN 및 AVN 이미징에 일상적으로 사용할 수 있습니다.
파라핀 임베딩, 절편 및 항원 회수가 필요한 기존의 면역조직화학과 같은 표준 방법과 비교할 때, 전체 장착 방법론은 SAN 및 AVN의 정확한 3D 국소화 및 형태를 해결하고 조직 형태가 최소한의 조직 탈수 및 물리적 파열만으로 상당히 보존되기 때문에 주변 조직과의 관계를 조사하는 데 유리합니다. 또한, 면역반응성 (즉, 조직 항원에 대한 항체의 결합) 또한 높게 유지된다.
우리는 플라스틱12,13
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 중국 장학위원회 (CSC, R. Xia), 독일 심혈관 연구 센터 (DZHK; 81X2600255에서 S. Clauss, 81Z0600206에서 S. Kääb), 코로나 재단 (S199 / 10079 / 2019에서 S. Clauss), SFB 914 (프로젝트 Z01에서 H. Ishikawa-Ankerhold 및 S. Massberg 및 프로젝트 A10에서 C. Schulz까지), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910에서 S. Clauss까지) 및 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게). 기금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anesthesia | |||
| Isoflurane 기화기 시스템 | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | 유도 챔버, 가스 배출 장치 및 숯 필터 포함 |
| 수정된 Bain 회로 | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | 마우스용 마취 마스크 포함 |
| 수술 플랫폼 | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| 미세 집게 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| 조직 겸자 | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| 조직 핀 | Fine Science Tools | 26007-01 | 27G 바늘을 대체품으로 사용할 수 있습니다. |
| General lab instruments | |||
| orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| 자기 교반기 | IKA | RH 기본 | |
| 피펫, 볼륨 10 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| 현미경 | |||
| 해부 실체 줌 현미경 | VWR | 10836-004 | |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 & 마이크로; m 주사기 필터 | Sartorius | 17597 | |
| 100mm 페트리 접시 | Falcon | 351029 | |
| 27G 바늘 | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50ml 폴리프로필렌 원추형 튜브 | Falcon | 352070 | |
| 5ml 주사기 | Braun | 4606108V | |
| 커버 슬립 | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | TEA |
| 16% 포름알데히드 용액 | Thermo Scientific | 28908 | 4% 용액으로 사용 |
| 아세트산 | Merck | 100063 | TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Gibco | 14190-094 | |
| 일반 염소 혈청 | 시그마 | NS02L | |
| 자당 | 시그마 | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche TRIS-RO | 구성 요소 TEA | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | 에서 1%로 희석 PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| 산소 5 L | Linde | 2020175 | 압력 조절기 포함 |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | 1:200으로 희석 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | 1:1000으로 희석 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | 를 1:200으로 희석 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | 자체 설계 및 3D 프린팅 | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | 잭슨 연구소 |
참고문헌
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
