우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.
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이 논문에서
요약
초록
DNA 나노 기술은 다양한 응용 프로그램에 대한 사용자 처방 모양과 역학으로 핵산의 프로그래밍 가능한 자체 조립을 가능하게합니다. 이 연구는 DNA 나노 기술의 개념이 파지 유래 T7 RNA 폴리머라제(RNAP)의 효소 활성을 프로그래밍하고 확장 가능한 합성 유전자 조절 네트워크를 구축하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 첫째, 올리고뉴클레오티드 테더드 T7 RNAP는 N단말 스냅 태그 RNAP의 발현과 SNAP 태그의 후속 화학 결합을 벤질구아닌(BG)-변형 올리고뉴클레오티드와 결합하여 설계된다. 다음으로, 핵산 가닥 변위는 주문형 폴리머라제 전사를 프로그래밍하는 데 사용된다. 또한, 보조 핵산 어셈블리는 DNA 템플릿을 사용하여 DNA 프로그래밍된 T7 RNAP 간의 상호 작용을 조절하기 위해 "인공 전사 인자"로 사용될 수 있다. 이 시험관 내 전사 규제 메커니즘은 디지털 논리, 피드백, 계단식 및 멀티플렉스와 같은 다양한 회로 동작을 구현할 수 있습니다. 이 유전자 규제 아키텍처의 컴포지토리는 설계 추상화, 표준화 및 확장을 용이하게 합니다. 이러한 기능은 생체 감지, 질병 검출 및 데이터 저장과 같은 응용 분야에 대한 시험관 내 유전 장치의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다.
서론
DNA 컴퓨팅은 계산을 위한 매체로 디자인된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용합니다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 사용자 지정 논리에 따라 동적으로 조립하고 특정 핵산 입력에 반응하기 위해 서열로 프로그래밍됩니다. 개념 증명 연구에서, 계산의 출력은 전형적으로 겔 전기전도 또는 형광 판 판독기를 통해 검출될 수 있는 형광표형 올리고뉴클레오티드 세트로 구성됩니다. 지난 30년 동안 다양한 디지털 로직 캐스케이드, 화학 반응 네트워크 및 신경망1,2,3과같이 점점 더 복잡해지는 DNA 전산 회로가 입증되었습니다. 이러한 DNA 회로의 제조를 지원하기 위해, 수학적 모델은 합성 유전자 회로4,5의기능을 예측하는 데 사용되었으며, 직교 DNA 서열 설계6,7,8,9,
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프로토콜
1. 버퍼 준비
참고: 단백질 정제 완충제 준비는 어느 날 발생할 수 있습니다. 여기에서 실험을 시작하기 전에 수행되었습니다.
- 50m 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 300mM 염화나트륨(NaCl), 5% 글리세롤, 5mM mM β-메르카포에탄올(BME), pH 8을 함유한 리시스/평형 버퍼를 준비한다. 1M Tris 1.5mL, 5M NaCl 1.8mL, 글리세롤 1.5mL, 25.2mL의 탈량(ddH2O)을 50mL 원심분리튜브에 추가하고 사용하기 직전에 14.2M BME의 10.5 μL을 추가합니다.
참고: 트리는 급성 독성을 일으킬 수 있습니다. 따라서 먼지를 호흡하지 말고 피부와 눈접촉을 피하십시오. BME는 독성이 있으며 연기 후드에만 사용해야합니다. 재서스펜션 및 세포 리시스 직전에 BME를 마지막으로 추가하는 것이 중요합니다. 용해 버퍼 수식의 표 1을 참조하십시오. - 50m Tris, 800mM NaCl, 5% 글리세롤, 5mM BME, 20m mM imidazole를 함유한 세척 버퍼(pH 8)를 준비합니다. 1 M Tris의 1.5mL, 5M NaCl의 4.8mL, 글리세롤 1.5mL, ddH2mL 22....
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결과
그림 5: SNAP T7 RNAP 발현 및 체외 전사 분석의 SDS-PAGE 분석. (A)SNAP T7 RNAP 단백질 정제 분석, SNAP T7 RNAP 분자량: 119.4kDa. FT = 컬럼에서 의 흐름을 통해, W1 = 용출 분획불을 포함하는 세척 버퍼, 정제 된 제품을 포함하는 E1-3 = 용출 분획, 및 DE = 10 배 희석 총 탈염 용출. 4-12% 프리캐스트 비스-트리스 단백질 젤, 스테인: 쿠마시 블루, 러닝 버퍼: MES 버퍼, 조건: 200 V 35 분 동안 .(B)시험관 내 전사 분석은 시간이 지남에 따라 형광 압태의 생산을 측정하여 SNAP T7 RNAP.......
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토론
이 연구는 N-말단 태그 재조합 T7 RNAP를 BG 기능화 올리고뉴클레오티드와 공동으로 결합하여 T7 RNA 폴리머라제의 활성을 제어하는 DNA 나노 기술에서 영감을 얻은 접근법을 시연하며, 이는 이후 TMDSD 반응을 프로그래밍하는 데 사용되었습니다. 설계에 의하면, SNAP 태그는 폴리머라제의 N-종착체에 위치하였으며, 야생형 T7 RNAP의 C-종점은 단백질 구조 코어 내에 묻혀 DNA템플릿(28)과중요한 접촉을 한다. 폴리머라제 C-종체를 수정하려는 사전 시도는 다른 보상 돌연변이가 도입되지 않는 한 효소 활성의 완전한 손실을 초래했다. 29,30 대조적으로, T7 RNAP의 N 단말 융합은 잘 용납되지만, 융합 태그의 선택은 중합체 활성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 태그가 RNAP 활동에 미치는 영향은 체계적으로 결정되지 않았습니다. SNAP 태그는 효율적이고 견고하기 .......
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공개 사항
저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.
감사의 글
L.Y.T.C 연구 기금 탐사 (NFRF-E), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트, 캐나다 최초의 연구 우수 기금 (CFREF)의 자금을 받는 디자인 이니셔티브에 의한 토론토 대학의 의학에서 관대 한 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 폴리소르베이트 20(TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 바이오 베이직 | SD8135 | |
| 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7) | 10mM 완충액을 만드는 데 사용되는 | 바이오 베이직 | PD0435 |
| 10% 과황산암모늄(APS) | 시그마 알드리치 | A3678-100G | |
| 100kDa 아미콘 울트라-15 원심 분리기 필터 유닛 | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% 아세톤 | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% 에탄올 (EtOH) | 하우스 브랜드 | 39752-P016-EAAN | |
| 10x 체외 전사(IVT) 완충액 | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충액 | Bio Basic | A0026 | |
| 1M 이소프로필 &베타;- d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) | 시그마 알드리치 | I5502-1G | |
| 1M 중탄산나트륨 완충액 | 시그마 알드리치 | S6014-500G | |
| 1M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스) | 시그마 알드리치 | 648311-1KG | |
| 1X 트리스-EDTA(TE) 버퍼 | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M 이미다졸 | 시그마 알드리치 | 56750-100G | |
| 2-메르캅토에탄올(BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M 아세트산나트륨 | 바이오 베이직 | SRB1611 | |
| 40% 아크릴아미드(19:1) | 바이오 베이직 | A00062 | |
| 4x LDS 단백질 샘플 로딩 버퍼 | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M 염화나트륨(NaCl) | 바이오 베이직 | DB0483 | |
| 5mM 디티오트레이톨(DTT) | 시그마 알드리치 | 43815-1G | |
| 6x 겔 로딩 염료 | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | B7024S | |
| 아가로스 B 분말 | 바이오 베이직 | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | S9151S | |
| BL21 유능한 대장균 | 애드진 | C2530H | |
| BLUeye prestained protein ladder | FroggaBio | PM007-0500 | |
| 브로모페놀 블루 | 바이오 베이직 | BDB0001 | |
| 쿠마시 블루(SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| 시아닌 염료(SYBR 골드 핵산 겔 염색) | Fisher Scientific | S11494 | |
| 시아닌 염료(SYBR 안전 핵산 겔 염색) | Fisher Scientific | S33102 | |
| 건조 디메틸 설폭사이드 (디엠소) | 피셔 사이언티픽 | D12345 | |
| 포름아미드 | 시그마 알드리치 | F9037-100ML | |
| 글리세롤 | 바이오 베이직 | GB0232 | |
| 카나마이신 설페이트 | BioShop | KAN201.5 | |
| 용해 육수 | 시그마 알드리치 | L2542-500ML | |
| 공작석 그린 옥살레이트 | 시그마 알드리치 | 2437-29-8 | |
| N,N,N'-테트라메틸에탄-1,2-디아민(TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼(20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| 올리고뉴클레오티드(케이지 안티센스) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| 올리고뉴클레오티드( 케이지 센스) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| 올리고뉴클레오티드 (공작석 그린 압타머 안티센스) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| 올리고뉴클레오티드(말라카이트 그린 압타머 센스) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| 올리고뉴클레오티드(전사 인자 A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| 올리고뉴클레오티드(전사 인자 B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| 올리고뉴클레오티드 3' 아민 변형(테더) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce strong ion exchange spin columns | Fisher Scientific | 90008 | |
| 플라스미드 인코딩 SNAP T7 RNAP 및 kanamycin resistance genes | Genscript | N/A | custom gene insert |
| protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP 믹스 | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche 미니 퀵 DNA 스핀 컬럼 | 시그마 알드리치 | 11814419001 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 알드리치 | T8787-100ML | |
| 초저 범위 DNA 사다리 | 피셔 사이언티픽 | 10597012 | |
| 요소 | BioShop | URE001.1 |
참고문헌
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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재인쇄 및 허가
