여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.
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이 논문에서
요약
초록
과거에는 장 상피 모델 시스템이 형질전환 세포주 및 일차 조직으로 제한되었습니다. 이들 모델 시스템은 전자가 원래의 조직 생리학을 충실하게 나타내지 않기 때문에 내재적인 한계를 가지며, 후자의 이용가능성은 제한된다. 따라서 그들의 응용 프로그램은 기초 및 약물 개발 연구를 방해합니다. 성인 줄기 세포 기반 오가노이드 (이하 오가노이드라고 함)는 그들이 파생 된 정상 또는 병든 상피 조직의 미니어처입니다. 이들은 상이한 위장관 (GI) 관 영역에서 매우 효율적으로 확립될 수 있고, 장기간의 확장성을 가지며, 시험관내 치료에 대한 조직 및 환자 특이적 반응을 시뮬레이션할 수 있다. 여기서, 장 유래 오가노이드 유래 상피 단층의 확립은 상피 장벽 완전성, 투과성 및 수송성, 항균 단백질 분비 및 조직학을 측정하는 방법과 함께 입증되었다. 또한, 장 유래 오가노이드 단층은 증식하는 줄기 및 경이 증폭 세포뿐만 아니라 주요 분화 된 상피 세포로 농축 될 수 있습니다. 따라서, 이들은 표적 세포에 대한 화합물의 효과 및 그들의 작용 방식을 연구하도록 맞춤화될 수 있는 모델 시스템을 나타낸다. 오가노이드 배양은 세포주보다 기술적으로 더 까다 롭지 만, 일단 확립되면 생체 내 상피 복잡성과 환자 간 이질성을 진정으로 나타내기 때문에 약물 개발의 후기 단계에서 실패를 줄일 수 있습니다.
서론
장 상피는 장의 발광 함량과 기저 조직 사이의 물리적 장벽 역할을합니다. 이 장벽은 인접한 세포 사이에 강한 세포 간 연결을 확립하는 단단한 접합에 의해 연결되는 주로 흡수성 장세포의 단일 상피층을 포함한다. 이 세포들은 장의 정점 (루멘)과 기저변을 분리하는 편광 상피 내막을 형성하면서 동시에 소화 된 영양소와 대사 산물의 부세포 수송을 조절합니다. 장세포 이외에, 잔, 파네스 및 장내분비 세포와 같은 다른 중요한 상피 세포도 점액, 항균 펩티드 및 호르몬을 각각 생산함으로써 장 항상성에 기여한다. 장 상피는 류신이 풍부한 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5 양성 (LGR5+) 줄기 세포를 장내 크립트의 바닥에 나누어 지속적으로 보충하여 위쪽으로 이동하여 다른 세포 유형으로 분화되는 트랜스 증폭 (TA) 세포를 생산합니다1. 식품 알레르겐, 의약 화합물 및 미생물 병원균에 대한 노출과 같은 유전 적 및 환경 적 요인에 의한 장 상피 항상성의 붕괴는 장 장벽 기능의 중단으로 이어집니다. 이러한 상태는 염증성 장 질환 (IBD), 체강 질환 및 약물 유발 GI 독성2를 포함한 여러 장 질환을 유발합니다.
장 상피에 대한 연구는 막 삽입물,....
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프로토콜
1. 배양용 시약 준비
참고: 생물 안전 캐비닛 내부의 모든 단계를 수행하고 세포 배양 작업에 대한 표준 지침을 따르십시오. 자외선은 생물 안전 캐비닛을 시작하기 전에 10 분 동안 사용됩니다. 사용 전후에 생물 안전 캐비닛의 표면을 70 % 에탄올에 적신 티슈 페이퍼로 청소합니다. 세포외 매트릭스 (ECM)의 3차원 방울의 형성을 용이하게 하기 위해, 96-, 24-, 및 6-웰 플레이트의 예열 스톡을 37°C의 인큐베이터에서 준비된 상태로 유지한다.
- 기초 중간 준비
- Ham's Nutrient Mixture F-12(Ad-DF) 배지 병과 함께 500mL Advanced Dulbecco의 개질 이글 배지에 기본 배지(BM)를 준비하여 200mM 글루타민 5mL, 1M 4-(2-하이드록시에틸)-1피페라진에탄술폰산(HEPES) 5mL, 페니실린/스트렙토마이신(펜/스트렙) 용액 5mL(10,000 U/mL 또는 10,000 μg/mL)를 첨가합니다. 이것은 적어도 4주 동안 4°C에서 냉장고에 저장될 수 있다.
- Wnt 소스
- 앞서 기술된 방법26에 따라 Wnt3a 컨디셔닝 배지(Wnt3aCM)를 준비한다.
참고 :....
- 앞서 기술된 방법26에 따라 Wnt3a 컨디셔닝 배지(Wnt3aCM)를 준비한다.
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결과
도 1A는 이를 동결 상태로부터 해동시킨 후의 장내 오가노이드의 대표적인 밝은 필드 이미지를 도시한다. 최적의 회복을 보장하기 위해 오가노이드를 고밀도로 해동하는 것이 중요합니다. 오가노이드는 약 10μL의 ECM 돔에 있는 24웰 또는 6웰 플레이트에 도금됩니다(그림 1B). 대부분의 정상적인 장 오가노이드는 낭성 형태를 가지고 있습니다. 해동 과정에서 회복 된 후, 오가노이드는 더 큰 크기로 자라며 오가노이드 배양에 따라 3-7 일 후에 계대 될 준비가됩니다 (그림 1C). 오가노이드를 수확하고 ECM을 세척한 후(도 1D), 오가노이드는 기계적 전단에 의해 작은 크기로 파쇄될 수 있다. 오가노이드의 형태학(낭성 그림 1C, 신진 그림 1E)에 따라 오가노이드는.......
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토론
이 프로토콜은 장 오가노이드의 일반적인 조작 및 유지뿐만 아니라 이러한 오가노이드로부터 유래된 상피 단일층의 준비 및 가능한 응용을 기술한다. 현재까지, 단층은 십이지장, 장폐색 및 정상 뿐만 아니라 이전에 그리고 활발하게 염증을 일으킨 장 조직으로부터 유래된 결장 오가노이드의 상이한 영역으로부터 성공적으로 제조되었다(공개되지 않은 데이터). 환자 유래 오가노이드 단일층의 적용은 다양한 약물 치료에 대한 환자 특이적 반응의 연구뿐만 아니라 질병 및 환자 특이적 방식으로 장벽 기능의 연구를 용이하게 한다. 세포주는 장내 장세포 및 잔 유사 세포를 포함하는 분화되고 편광된 단층을 형성할 수 있지만, 이들 세포주에서 많은 상이한 효소 및 운반체가 비정상적으로 발현되어 복잡성 및 생리학적 관련성이 감소된다3,30. 오가노이드 배양은 세포 배양보다 기술적으로 더 까다롭고 힘들다. 그러나, 오가노이드는 생체내 상황을 더 대표하지만, 세.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) 공공 - 민간 파트너십 (PPP) 프로젝트 번호 LSHM16021 Organoids와 함께 네덜란드 LSH 부문의 수당을 Hubrecht Organoid Technology (HUB) 및 HUB 내부 자금 조달 질병 모델링 및 독성학 부서에 대한 독성학 모델링을위한 새로운 도구로 지원합니다. 우리는 Sabine Middendorp (소아 위장병학, Wilhelmina Children 's Hospital, UMC, Utrecht)와 Hugo R. de Jonge와 Marcel J.C. Bijvelds (위장병 및 간학과, Erasmus MC, Rotterdam)의 실험실에 멤브레인 삽입물에 단층을 설정하는 초기 기술 지원을 제공 한 것에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
2+
세포 Ca세포, , , , , ,
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 15 mL 원뿔형 튜브 | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24웰 세포 배양 플레이트 | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24웰 HTS Fluoroblok 트랜스웰 플레이트(광밀) | Corning | 351156 | |
| 24웰 HTS 트랜스웰 플레이트(표 1) | Corning | 3378 | |
| Transwell 인서트가 있는 24웰 플레이트 | Corning | 3470 | |
| 40 µ m cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL 코니컬 튜브 | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well 세포 배양 플레이트 | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96웰 HTS 플루오로블록 트랜스웰 플레이트 | Corning | 351162 | |
| 96웰 HTS 트랜스웰 플레이트(표 1) | Corning | 7369 | |
| 96웰 투명 배양 플레이트 | Greiner bio-one | 655180 | |
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| 광학 접착제 커버 | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
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| 플레이트 쉐이커 | Panasonic | ||
| PowerUp, SYBR, 그린 마스터 믹스 | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | 일차 세포용 항균 제형 |
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| 멀티채널 피펫용 시약 저장소 | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler(24-프로브 또는 96C-프로브 | 포함) WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS 특수 염색 키트 | , Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase 세트 | Qiagen | 79254 | |
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| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
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| Y27632 (ROCK 억제제) | AbMole | M1817 |
참고문헌
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- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permea....
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