다중 컬럼 플레이트 어댑터를 사용하면 크롬노그래피 컬럼을 병렬 친화성 또는 이온 교환 정제를 위한 다중 웰 컬렉션 플레이트와 인터페이스하여 경제적인 높은 처리량 단백질 정제 방법을 제공합니다. 그것은 중력 또는 진공 산출 밀리 그램 양의 단백질을 통해 저렴 한 계측을 통해 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 정제는 단백질 구조 및 기능에 대한 연구에 필수적이며 일반적으로 생물 물리학 기술과 함께 사용됩니다. 그것은 또한 새로운 치료의 개발에 핵심 구성 요소. 기능성 프로테오믹스의 진화하는 시대는 이를 용이하게 하기 위해 고처리량 단백질 정제 및 개선된 기술에 대한 수요를 촉진하고 있다. 다중 컬럼 플레이트 어댑터(MCPA)가 병렬 정제를 위해 다중 웰 플레이트와 다른 수지의 여러 크로마토그래피 컬럼을 인터페이스할 수 있다고 가설이 있었습니다. 이 방법은 자동화 된 시스템의 속도에 필적하는 중력 이나 진공 하에서 사용할 수있는 경제적이고 다양한 단백질 정제 방법을 제공합니다. MCPA는 후속 특성화 및 분석을 위한 저렴하고 시간 효율적인 방법으로 단백질의 밀리그램 수율을 회수하는 데 사용할 수 있습니다. MCPA는 SH3 도메인의 높은 처리량 선호도 정화에 사용되었습니다. 이온 교환은 또한 단백질 포스트 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 정화하기 위해 MCPA를 통해 입증되었으며, 이는 이 시스템이 다른 정제 유형에 어떻게 적응될 수 있는지를 나타냅니다. 여러 열로 설정하기 때문에 파라미터의 개별 사용자 지정은 현재 플레이트 기반 방법에 의해 달성 할 수없는 동일한 정제로 이루어질 수 있습니다.
서론
정제된 단백질의 밀리그램 양을 달성하는 단백질 정제 기술은 특히 NMR과 같은 생물 물리학 적 방법에 대한 특성화 및 분석에 필수적입니다. 단백질 정제는 또한 약물 발견 과정 및 단백질 단백질 상호 작용 연구와 같은 연구의 다른 영역에 걸쳐 중심; 그러나, 이러한 양의 순수 단백질을 달성하는 것은 이러한 기술에 대한 병목 현상이 될 수 있다1,2,3. 단백질 정화를 위한 주요 방법은 단백질과 그들의 꼬리표의 개별적인 특성에 의존하는 다양한 방법을 포함하는 크로마토그래피입니다. 친화도 크로마토그래피에서, 단백질은 크로마토그래피 수지4에특정 기판에 대한 친화력을 갖는 태그로 작동하는 추가 단백질 또는 펩티드 모티프를 가지고 있다. 가장 일반적인 친화성 방법은 그의 태그 단백질을 사용하여 고정 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)이며, 또 다른 인기있는 방법은 충전에 따라 단백질을 분리하는 이온 교환 크로마토그래피입니다. 최고 순도를 위해 친화도 크로마토그래피와 이온 교환의 조합이 자주 함께 사용되며 일반적으로 고처리량에 대한 고가의 실험실 장비가 필요합니다.
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프로토콜
1. Ni-NTA 크로마토그래피 를 부인
- 버퍼 준비
참고: 모든 버퍼에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.- 0.5 M NaOH의 500mL를 구성하여 먼저 밀리-Q 물을 추가한 다음 비커가 교반기위에 있는 동안 NaOH를 천천히 추가하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터링합니다.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 0.1 M 니켈 황산염 및 필터의 100mL를 준비합니다.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 2M 이미다졸의 50mL를 준비하고 필터를 필터링합니다.
- 준비 및 0.22 μm 필터 1.5 L pH 8.0에서 5.3 mM Tris-HCl, 4.7 mM Tris-base (Tris (하이드록시메틸) 메틸라민), 13.7 mM NaH2PO4,86.3 mM Na2HPO4 및 6 M guani.
- 준비 및 0.22 μm 필터 500 mL의 용해 완충액 10 mM imidazole 는 2 M imidazole 주식을 사용하여 데마링 버퍼 (1.1.4 참조)에 용해된다.
- 준비 및 0.22 μ....
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결과
예를 들어, MCPA는 Ni-NTA(그림2A)를통해 데칭 조건에서 14개의 AbpSH3 돌연변이를 성공적으로 정제하였다. 작은 오염 물질 ~ 25 kDa를 볼 수 있지만 단백질은 여전히 대체로 순수합니다. 이 오염 물질은 대장균11에서발견되는 일반적인 공동 정제 단백질인 YodA로여겨진다. 도 2B는 네이티브 조건하에서 11개의 서로 다른 SH3 도메인의 정제를 나타낸다. 데니징 조건에서 볼 수 있는 작은 오염 물질은 네이티브 조건에서 제거됩니다. 이는 MCPA가 표 1에 나열된 네이티브 또는 데니어링 버퍼로 구성된 정제를 비교하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.
IEX MCPA를 통한 용액의 정화를 위한 대표적인 데이터는 도 3에도시된다. 이.......
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토론
이 방법은 상대적으로 경험이 부족한 단백질 생화학자에게 사용하기쉽고 견고하지만 몇 가지 고려 사항이 있습니다.
컬렉션 플레이트 과충전에 대한 주의 사항
48웰 컬렉션 플레이트 자체는 우물당 5mL에 불과하며 각 96웰은 2mL에 불과합니다. 우물을 과도하게 채울 위험이 있기 때문에 버퍼를 추가하고 열을 통해 샘플을 실행할 때 이 점을 염두에 두어야 합니다. 특히, 더 큰 샘플을 정제를 위해 크로마토그래피 컬럼으로 옮길 때 주의를 기울여야 한다. 과잉 상퍼가있는 경우, 부품으로 분할, 열을 채우기에 충분, 이는 샘플의 초과 및 손실을 방지하기 위해 다음 부분을 추가하기 전에 통해 실행할 수 있어야합니다. 상체의 각 추가 후, 컬럼은 펌프를 켜기 전에 구슬에 결합하는 단백질의 가능성을 높이기 위해 작은 플라스틱 루프와 혼합되어야합니다. 플레이트의 방향과 따라서 우물의 내용을 추적하려면 맞춤화를 시작하기 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 간행물에서 보고된 연구는 보조금 번호 P20GM103451및 리버풀 대학에서 내부 연구 교부금의 국립 의학 과학의 국립 학회에서 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2mL/웰 수집 플레이트 | , Agilent technologies | , 201240-100 | |
| 5mL/웰 수집 플레이트 | , Agilent technologies | , 201238-100 | |
| 12mL 크로마토그래피 컬럼 | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96웰, 긴 드립 플레이트 | Agilent technologies | , 200919-100 | 제거해야 하는 0.25um 필터와 함께 제공됩니다. |
| 96 웰 플레이트 씰/매트 | Agilent Technologies | 201158-100 | 피어세퍼여야 합니다 |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP 음이온 교환 컬럼 | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis 플레이트 리더 | BMG LABTECH | FLUOstar Omega 플레이트 리더와 호환 | |
| 가능 Male leur 플러그 | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 웰 진공 매니폴드 스타터 키트 | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| 저장소 수집 플레이트 | Agilent Technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | 5 mL 및 50 mL 주사기 포함 |
| VACUSAFE 진공 | INTEGRA | 158 320 | 진공 안전 진공은 300mBar에서 600mBar까지의 진공 범위와 4L 폐기물 수집 병을 가지고 있습니다 |
참고문헌
- Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
- Renaud, J. P., et al.
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재인쇄 및 허가
