확장 현미경 검사법을 가진 Podocytic 단백질 Nephrin, 액틴 및 포도신의 화상 진찰

요약

제시된 방법은 확장 현미경으로 형광 표지된 세포 단백질의 시각화를 가능하게 하고 전통적인 현미경에 70 nm의 해상도로 이끌어 냅니다.

초록

구체 내피, 구체 지하 막 및 podocytes로 구성된 구체 필터의 중단은 알부무뇨증을 초래한다. Podocyte 발 프로세스는 podocin와 같은 세포켈레탈 어댑터 단백질에 결합하는 액틴 번들을 포함합니다. 포도신과 같은 어댑터 단백질은 네프린과 같은 구슬빛 횡격막의 중추를 액틴 세포 골격에 연결합니다. 이들과 그밖 podocytic 단백질의 현지화 그리고 기능을 공부하는 것은 건강과 질병에서 구체 필터의 역할의 이해에 필수적입니다. 제시된 프로토콜은 사용자가 기존의 현미경에 슈퍼 해상도 이미징을 사용하여 세포에서 액틴, 포도신 및 nephrin을 시각화할 수 있게 합니다. 첫째, 세포는 종래의 면역 형광 기술로 염색된다. 시료 내의 모든 단백질은 팽창 가능한 하이드로겔에 공유적으로 고정됩니다. 단백질제 K를 함유한 소화를 통해 구조 단백질은 마지막 단계에서 겔의 이소열대 부종을 허용합니다. 물에서 샘플의 투석은 샘플의 4-4.5 배 팽창을 초래하고 샘플은 기존의 형광 현미경을 통해 이미지 될 수있다, 70 nm의 잠재적 인 해상도를 렌더링.

서론

알부미뇨증은 심혈관 위험의 대리 매개 변수이며 사구형 필터^1의중단으로 인한 결과입니다. 구체 필터는 포도세포에 의해 형성된 회향성 내피, 구체 지하 막 및 슬릿 다이어프램으로 구성됩니다. 포도세포의 기본 및 이차 발 공정은^구체2의 모세관 벽을 감싸는다. 발 과정의 섬세한 구조는 또한 다중 슬릿 다이어프램 단백질 및 기타 어댑터 단백질^2에대한 앵커 역할을 하는 피질 액틴 번들에 의해 유지된다. 슬릿 다이어프램의 백본 단백질은 신장이라고 불리며 반대 되는 podocytes의 네프린 분자와 동종 방식으로 상호 작용합니다. 다양한 어댑터 단백질을 통해, 네프린은 액틴 세포골격^2,3에연결된다. 신장 인코딩 유전자 NPHS1의 돌연변이는 핀란드 형^4의신 증후군으로 이어집니다.

네프린의 상호 작용 단백질 중 하나는 스토마틴 가족^3의헤어핀 과 같은 단백질인 포도신입니다. 포도신은 지질 뗏목에 nephrin을 모집하고 액틴 세포 골격

프로토콜

1. 세포의 분할 및 파종

1. 멸균 덜벡코의 변형 독수리 매체(DMEM)를 포함하여 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 멸균 인산염 완충식식염수(PBS) 및 멸균 트립신을 37°C로 드실 수 있습니다. 깨끗한 벤치를 활성화합니다.
2. 멸균 집게를 사용하여 각 웰에 멸균 유리 커버 슬립 (10mm)을 추가하여 6 웰 플레이트를 준비하십시오.
3. 깨끗한 벤치 아래에 Cos7 세포가있는 10cm 세포 배양 접시를 넣습니다. 클린 벤치 아래에서 진공 장치를 사용하여 셀의 매체를 흡인합니다.
4. 한 손에 는 멸균 된 세포 배양 접시를 잡고 세포 배양 접시의 측면에 멸균 PBS 10 mL을 추가하여 세포에서 헹구지 않도록하십시오. PBS가 전체 세포 배양 접시를 헹구기 위해 세포 배양 접시를 내려 놓습니다.
5. PBS를 제거하고 세포 배양 접시의 중간에 트립신 1mL을 추가하고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
6. 10% FCS를 포함한 DMEM의 10mL를 추가하여 피펫기로 셀 용액을 위아래로 피펫하여 수동으로 세포를 분리하여 트립시화 반응을 중지합니다.
7. 카운팅 챔버를 사용하여 밀리리터당 셀 수를 분석합니다.
8. 6-웰 플레이트에서 유리 커버 슬립에 잘 2 mL 배지에 68,....

결과

이 proExM 프로토콜의 개념과 타이밍은 그림 1에묘사됩니다. 5일째, 전감염된 세포는 관심 있는 단백질을 표적으로 하는 형광 항체로 고정되고 염색된다(도1A,B). 6일째, AcX를 가진 처리는 모든 단백질에 아민 단의 형성으로 이끌어 냅니다 (형광을 포함)(도 1A,B)^12. 하이드로겔의 중합시, 이들 아민 군은 하이드로겔(6일째)에 일연게 결합한다. 겔의 중합 후, 균질화(소화)는 단백질효소 K로 수행되어 세포의 구조적 단백질이 파괴된다(6일째, 도 1A,B). 형광으로 표지된 항체는 소화 후에 주로 보존된 남아 있습니다.......

토론

제시된 방법은 조사자가 세포 단백질, 예를 들면, podocin, nephrin 및 cytoskeletal 분대, 예를 들면, F-actin를 구상하는 것을 가능하게 합니다. 이 프로토콜 내에서, 전감염된 cos7 세포는 F-actin와 슬릿 다이어프램 단백질의 상호 작용을 연구하는 모델로 이용됩니다. 불행하게도, 불멸의 podocyte 세포주 슬릿 다이어프램 단백질의 충분한 내인성 양을 표현하지^{않는다(19)}.

이 방법을 통해 세포 단백질은 기존의 형광 현미경을 사용하여 나노 스케일 해상도로 시각화 될 수 있습니다. 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) AcX와 하이드로겔에 단백질 아민 그룹의 충분한 고정, 2) 하이드로겔의 적절한 중합, 3) 소화를위한 최적의 타이밍 및 4) 호환 형광의 선택.

하이드로겔에 세포 단백질을 고정하는 것은 확장 시 하이드로겔 내의 단백.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아크릴아미드 >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((아크릴로일)아미노)헥산, 숙시니미딜 에스테르, 아크릴로일-X, SE	인비트로젠	A-20770	최대 4개월 동안 저장
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckglä 엥	겔브레히트	K12432	24x32mm #1.0
디아몬트 커터	VWR	201-0392	커버 슬립 절단
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M 재고는 RT
Marten 헤어 페인트 브러시	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckglä에 보관할 수 있습니다. SER (커버 안경)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N'-메틸렌비사아크릴아미드	시그마-알드리치	M7256-25G
Objektträ ger UniMark	Marienfeld	703010
단백질분해효소 K	New England Biolabs	P8107S
아크릴산 나트륨	시그마-알드리치	408220	순도 확인
대학의 워크숍에서 생산
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well 유리 바닥 판	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
	크롬트라	사용 불가	1:40
토끼에서 생산 안티 포도신	시그마	P-0372-200UL	1:200
당나귀 안티 기니피그 CF633	시그마	SAB4600129-50UL	1:200
염소 안티 토끼 488	Life Technologies	A11034	1:1000
기니피그 안티 네프린	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	불가

은 된 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 염색 챔버 Actin-ExM 546