Method Article

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somitogenesis는 척추 동물 배아 발달의 특징입니다. 수년 동안 연구자들은 생체외 및 시험관 내 접근법을 포괄하는 광범위한 기술을 사용하여 다양한 유기체에서이 과정을 연구해 왔습니다. 그러나 대부분의 연구는 여전히 2차원(2D) 이미징 데이터의 분석에 의존하고 있으며, 이는 복잡한 3D 공간에서 매우 역동적인 상호작용을 수반하는 축방향 확장 및 소미토제네시스와 같은 발달 과정에 대한 적절한 평가를 제한합니다. 여기서는 마우스 라이브 이미징 획득, 데이터 세트 처리, 시각화 및 분석을 3D 및 4D로 하여 이러한 발달 과정에 관여하는 세포(예: 신경중배엽 선조)를 연구할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 또한 마우스 배아에서 광학 프로젝션 단층 촬영 및 전체 마운트 면역 형광 현미경 검사 (샘플 준비에서 이미지 수집까지)를위한 단계별 프로토콜을 제공하고 3D 이미지 데이터를 처리하고 시각화하기 위해 개발 한 파이프 라인을 보여줍니다. 우리는 이러한 기술 중 일부의 사용을 확장하고 축 방향 확장 및 소마이트 형성 (예 : 3D 재구성)에 대한 현재의 이해를 향상시키는 데 사용할 수있는 다양한 사용 가능한 소프트웨어 (예 : 피지 / ImageJ, Drishti, Amira 및 Imaris)의 특정 기능을 강조합니다. 전체적으로 여기에 설명 된 기술은 발달 생물학에서 3D 데이터 시각화 및 분석의 중요성을 강조하며 다른 연구자가 척추 동물 축 확장 및 세분화의 맥락에서 3D 및 4D 이미지 데이터를보다 잘 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로,이 연구는 또한 척추 동물 배아 발달을 가르치기 위해 새로운 도구를 사용합니다.

Introduction

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척추 동물의 체축 형성은 배아 발달 중에 발생하는 매우 복잡하고 역동적 인 과정입니다. 위축이 끝날 때 [마우스에서, 배아 일 (E) 8.0 전후], 신경 중배엽 선조 (NMPs)로 알려진 에피아세포 전구 세포 그룹이 머리에서 꼬리 서열에서 축 방향 확장의 핵심 동인이되어 목, 몸통 및 꼬리 형성 중에 신경관과 동축 중배엽 조직을 생성합니다 1,2,3,4 . 흥미롭게도, 이러한 NMP가 인과성 표피세포에서 차지하는 위치는 중배엽 또는 신경외배엽(neuroectoderm5)으로 분화하는 결정에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 현재 NMP에 대한 정확한 분자 지문이 부족하지만, 이들 세포는 일반적으로 T (Brachyury)와 Sox2 5,6을 공동 발현하는 것으로 생각된다. NMP 운명 결정을 조절하는 정확한 메커니즘 (즉, 신경 또는 중배엽 경로를 취하는지 여부)은 정확하게 정의되기 시작했습니다. 원시적 줄무....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물과 관련된 실험은 주택, 축산 및 복지에 관한 포르투갈 (Portaria 1005/92) 및 유럽 (지침 2010 / 63 / EU) 법률을 따랐습니다. 이 프로젝트는 'Instituto Gulbenkian de Ciência'의 윤리위원회와 포르투갈 국가 단체 인 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária'(라이센스 참조 : 014308)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 3D 및 4D 이미징을 위한 샘플 준비

참고: 여기서는 라이브 이미징을 위해 마우스 E8.25 ~ E10.5 배아(1.1), 전체 탑재 면역형광 현미경(1.2)용 E7.5 ~ E11.5 배아 및 광학 투영 단층촬영용 태아(1.3)를 해부하고 준비하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

  1. 라이브 이미징을 위한 샘플 준비
    1. 마우스 배아 해부 및 라이브 이미징을 위한 준비(예를 들어, LuVeLu 리포터 23).
      1. E8.25와 E10.5 사이의 마우스 배아를 미리 가온된 M2 배지(37°C)에서 해부한다. 깨끗한 포셉을 사용하여 노른자 낭을 부드럽게 제거하고 신선한 M2 배지로 배아를 한 번 씻어 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

살아있는 및 면역형광 이미징 둘 다에 대해 본 논문에 나타난 대표적인 결과는, 20 × 1.0 NA 물 목표물, 960 nm로 튜닝된 여기 레이저, 및 GaAsP 광검출기 (Dias et al. (2020)43에 기재된 바와 같이)를 갖는 이광자 시스템을 사용하여 수득되었다. 광학 프로젝션 단층 촬영은 맞춤형 OPenT 스캐너를 사용하여 수행되었다 (Gualda et al. (2013)28에 기재된 바와 같이).

라이브 이미징(4D 분석)
축 연장 동안 마우스 배아에서의 LuVeLu 리포터 활성의 대표적인 분석을, "라이브 이미징을 위한 샘플 준비"에 대해 기술된 프로토콜에 따라 수득한다(단계 1.1; "3D 이미징을 위한 샘플 준비" 섹션), "라이브 이미징 데이터 세트 전처리"(단계 3; "이미지 데이터 세트 전처리" 섹션) 및 "Imaris를 이용한 3D.......

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Discussion

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축 신장과 세분화는 척추 동물 배아 발달 중에 발생하는 가장 복잡하고 역동적 인 과정 중 두 가지입니다. 단일 세포 추적과 함께 3D 및 4D 이미징의 사용은 한동안 제브라 피쉬와 닭 배아 모두에서 이러한 과정을 연구하기 위해 적용되었으며, 접근성과 배양 조건은 복잡한 이미징을 용이하게합니다 19,44,45,46,47,48,49 . 대조적으로, 마우스 배아의 중간 및 후기 유기생성 단계는 그러한 세부 사항에서 제대로 연구되지 않은 채로 남아 있지만, 예를 들어 생체 내 영상(50

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LuVeLu 기자 균주에 대한 Olivier Pourquié와 Alexander Aulehla, RapiClear 테스트 샘플의 SunJin 실험실, BigStitcher를 사용하여 도움을 주신 Hugo Pereira, 라이브 이미징 장치, IGC 동물 시설 및 Mallo 실험실의 과거와 현재 구성원에게 유용한 의견과 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

포르투갈 기금 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 및 ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017이 지원하는 IGC의 고급 이미징 시설의 기술 지원에 감사 드리며, 포르투갈 2020 파트너십 계약에 따라 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) 및 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)를 통해 Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020)이 공동 자금을 지원합니다. 이 원고에 설명 된 작업은 LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, 포르투갈) 및 SCML-MC-60-2014 (포르투갈 산타 카사 다 미세 리코 디아)를 M.M., 연구 인프라 Congento, 프로젝트 LISBOA-01-0145-FEDER-022170 및 박사 학위 펠로우십 PD....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아가로스 저겔화 온도시그마A9414배아 장착에 사용 (예: OPT용)
Amira 소프트웨어Thermofisher-Commerial소프트웨어 도구
Anti-Brachyury (염소 다클론)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235면역형광
Anti-Sox2 (토끼 단클론)Abcamab92494 RRID:AB_10585428용 면역형
Anti-Tbx6 (염소 다클론성)R and D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834면역형광
Anti-Laminin111 (토끼 다클론성)SigmaL9393 RRID:AB_477163면역형광
Anti-goat 488 (당나귀 다클론성)분자 프로브A11055 RRID:AB_2534102면역형광
Anti-rabbit 568 (당나귀 다클론성)써모피셔   ScientificA10042 RRID:AB_2534017면역
벤질알코올(99+%)(임의)-배아(BABB의 성분)를 제거하는 데 사용(모든)
질 벤조에이트(99+%)(모든)-배아(BABB의 성분)를 제거하는 데 사용)
소 혈청 알부민BiowestP6154면역형광
커버글라스 20x20 mm #0(모든)-100um 두께
의 커버 글라스 20x20 mm #1(임의)-170um 두께
의 커버 글라스 20x60 mm #1.5(임의)-"로 사용 슬라이드"
DAPI (4 ', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 린 돌 디 하이드로 클로라이드)Life TechnologiesD3571면역 형광
Drishti 소프트웨어(오픈 소스)-무료 소프트웨어 도구
EDTASigmaED2SS탈염
Fiji / ImageJ 소프트웨어(오픈 소스)-무료 소프트웨어 도구
GlycineNZYtechMB01401면역 형광
Huygens 소프트웨어Scientific Volume Imaging-Commerial소프트웨어 도구
HyClone 정의 소 태아 혈청GE Healthcare#HYCLSH30070.03라이브 이미징
용 과산화수소 용액 30 %Milipore1085971000
Imaris 소프트웨어Bitplane / Oxford 기기지우기 용Commerial 소프트웨어 도구
iSpacersSunJin Lab(varies)준비용 스페이서로 사용
L-glutamineGibco#25030– 024라이브 이미징 매체용
저포도당 DMEMGibco11054020라이브 이미징 매체용
M2 배지SigmaM7167배아 해부
메탄올VWRVWRC20847.307탈수 및 재수화 단계용
메틸 살리실레이트SigmaM6752배아 파라
포름알데히드SigmaP6148배아를 고정하는 용액에 사용
페니실린-스트렙토마이신시그마#P0781라이브 이미징 매체
PBS (인산염 완충 식염수)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52배아 제거에 사용
Secure-Sea 혼성화 챔버SigmaC5474스페이서로 사용 준비 simLab
소프트웨어SimLabsoft-Commerial 소프트웨어 도구
슬라이드, 함몰 오목 유리 - 75x25 mm(모든)-두꺼운 배아를 장착합니다.
Triton X-100SigmaT8787면역형광용
광 형광용 벤를 제거하는 데 사용용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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